PCR实验室在操作时应注意事项SLD中检实验室技术PDF打印版.pdfVIP

学 海 无 涯 PCR 实验室在操作时应注意事项 PCR （基因扩增实验室）检测微量感染因子时，操作人员容易因为污染而导 致各种问题。SLD 中检实验室技术根据多年行业经验，给出的建议是：进行 PCR 操作时，操作人员一定要严格遵守一些操作规程，最大程度地降低可能出现的 PCR 污染事故的发生。 一、PCR 实验室划分操作区： 目前，对于普通PCR，业内还无法做到单人单管和实现完全封闭管理操作， 但无论是否能够达到单人单管，均要求实验操作在三个不同的物理区域内进行， PCR 的前处理和后处理一定要设计在不同的隔离区内进行： 1、标本处理区，包括：扩增摸板制备; 2、PCR 扩增区，包括：反应液的配制和PCR 基因扩增; 3、产物分析区，包括：凝胶电泳分析，产物拍照及重组克隆制备。 各工作区要具有一定的隔离，操作器材要专用，而且要有一定方向性，如， 标本制备→PCR 扩增→产物分析→④产物处理。切记：产物分析区的产物 及器材严禁拿到前后两个工作区，避免交叉污染。 二、PCR 实验室试剂分装要求： PCR 扩增所需要的试剂均应在装有紫外灯的负压工作台或超净工作台进行 配制和分装，所有的吸头和加样器都需固定放于其中，吸头不能用来吸取扩增后 的 DNA 和其它来源 DNA： 1、PCR 用水应为高压的双蒸水; 2、引物和d-NTP 用高压的双蒸水在无 PCR 扩增产物区配制; 3、引物和d-NTP 应分装储存，分装时应标明分装时间，以备发生污染时及 时查找原因和追溯污染源头; 三、PCR 扩增重要标准 1、PCR 实验灵敏度 PCR 实验灵敏度：是指 PCR 扩增反应能够检测到目的基因的最小值。 研究结果表明，影响 PCR 扩增效率的因素，有模板的完整性、反应温度、 复杂程度、引物纯度及其与模板结合效率、DNA 聚合酶的热稳定性与扩增性能、 反应缓冲液的离子组成(主要指：阳离子)、反应优化剂等，这些因素都显著影响 1 学 海 无 涯 PCR 实验检测灵敏度。在最佳扩增条件下，常规 PCR 反应能够检测到 pg(10 ～ 12g)数量级目的基因。对于一个特定的目的基因，模板与引物通常都是已经限 定好的因素。因此，选择什么样的 PCR 反应体系(包括 DNA 聚合酶与反应缓冲 液等)就是研究者提高 PCR 实验灵敏度的关键因素了。 2、PCR 实验特异性 PCR 实验特异性：是指在 PCR 扩增过程中，专一性扩增目的片段而非其他 片段的性能。 在 PCR 实验本身的灵敏度很高，且实验条件未充分优化的情况下，通常会 在目的片段出现同时伴随有其它杂带，即发生非特异性扩增现象。模板、引物性 质及质量、反应条件控制等均会影响 PCR 扩增特异性。近年来的研究结果表明， 缓冲液品质(如反应优化剂、离子种类与组成等)对保证 PCR 特异性扩增起着重要 作用。 3、PCR 灵敏性和特异性关联 PCR 实验灵敏度与特异性是一对此长彼消特性，这也决定我们实验体系调 节实际上就是需要找到适合实验灵敏度与特异性的平衡点。由于 PCR 体系中的 成分众多，使得组合较多，筛选工作也就相对繁杂。 四、PCR 实验操作注意事项： 尽管 PCR 扩增序列的残留污染大部分是假阳性反应导致的，但样品间的交 叉污染也是常见原因之一。因此，不仅要在进行扩增反应时要谨慎对待，在样品 的收集、抽提和扩增的所有环节都应谨慎操作，一般需做到以下几点： 1、戴一次性手套，若不小心溅上反应液，应立即更换手套; 2、避免反应液飞溅，若不小心溅到手套或桌面上，应立刻更换手套并用稀 酸擦拭桌面; 3、使用一次性吸头，严禁与 PCR 产物分析室的吸头混用，吸头不要长时间 暴露于空气中，避免空气中气溶胶的污染; 4、操作多份样品时，制备反应混合液，先将 dNTP、缓冲液、引物和酶混 合好，然后再分装，这样既可以减少操作次数，避免污染，又可以增加反应的精 确度； 5、最后加入反应模板，加入后盖紧反应管; 6、操作时设立空白对照和阴阳性对照，既可验证 PCR 反应的可靠性，又可 2