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基本实验技术 1 二 基因表达与调控 三 蛋白表达与功能分析 一 分子克隆 四 免疫组织化学 五 细胞功能实验 六 流式细胞技术 2 2020-7-26 一 分子克隆 分子克隆指按照人的意愿，在体外将某种生物的DNA片断插入到载体（质粒、病毒等）中，形成遗传物质的新组合---重组DNA分子（重组子），然后将重组子转移到宿主细胞中进行复制或表达，即对DNA分子进行克隆，以获得该DNA分子的大量拷贝。 3 2020-7-26 目的基因的获得 目的基因与载体的连接 重组DNA分子导入受体细胞 筛选出含重组DNA分子的受体细胞克隆 克隆基因、克隆基因的表达 载体构建将编码某一多肽或蛋白质的基因（外源基因）组装到细菌质粒（质粒是细菌染色体外的双链环状DNA分子）中，再将重组质粒转入大肠杆菌，这样重组质粒就随大肠杆菌的增殖而复制，从而克隆基因或表达出外源基因编码的相应多肽或蛋白质。 4 2020-7-26 慢病毒载体（Lentiviral vector, LVs）是在 HIV-1病毒基础上改造而成的病毒载体系统，它能高效将目的基因（或 RNAi）导入动物和人的原代细胞或细胞系。 慢病毒稳定细胞株构建 5 2020-7-26 转染，是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。可通过转染干扰片段或过表达质粒，研究基因的作用。 siRNA转染在一周内有效，需要马上进行功能实验。但转染效率受细胞类型及细胞状态影响，对于难以转染的细胞，建议用慢病毒构建稳定细胞株再进行后续实验，比如神经元细胞、干细胞。 6 2020-7-26 实时定量 PCR (Real - Time Quantitative Polymerase ChainReaction) 是在经典 PCR技术基础上，通过在 PCR 反应体系中加入荧光基团，利用特定仪器检测荧光信号积累的强弱，进而实时监测每一轮 PCR 反应产物，并对与其产物量呈正相关的初始模板进行定量分析的技术。 二 基因表达与调控 7 2020-7-26 • 绝对定量(Absolute Quantification，AQ) 病原体检测 转基因食品检测 基因表达研究 • 相对定量(Relative Quantification，RQ) 基因在不同组织中的表达差异 药物疗效考核 耐药性研究 8 2020-7-26 引物设计 RNA提取 RNA逆转录 QPCR检测 数据处理 9 2020-7-26 染色质免疫共沉淀（Chromtin Immuno Precipitation， CHIP）是目前唯一研究体内 DNA与蛋白质相互作用的方法。它的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质-DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的 DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与 DNA 相互作用的信息。 研究DNA 甲基化 检测已知蛋白的靶基因 组蛋白修饰 染色质结构 转录因子的协同结合 10 2020-7-26 CHIP实验技术流程图 11 2020-7-26 蛋白免疫印迹( Western Blot) 是将电泳分离后的细胞或组织总蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF 膜上，然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术。 该技术广泛应用于检测蛋白水平的表达。 三 蛋白表达与功能分析 12 2020-7-26 13 2020-7-26 四 病理实验 免疫组织化学（Immunohistochemistry，IHC）是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），进行定位及相对定量研究的一种技术。能将目地抗原的表位及表达量直观的呈现出来 。 免疫荧光(Immunofluorescence，IF)是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光抗体（或抗原）作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。可以采用不同激发波长的荧光二抗标记不同的目的蛋白，同时观察两种蛋白的表达及共定位情况。 14 2020-7-26 TUNEL细胞在发生凋亡时，会激活一些 DNA内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA。基因组 DNA断裂时，暴露的 3’-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶的催化下加上荧光素标记的 dUTP，从而可以通过荧光显微镜或流式细胞仪进行检测。是分子生物学与细胞形态学相结合的研究方法