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LAMP技术及应用 湖北省疾控中心结防所 周丽平 1 安徽省胸科医院安徽省结防所 LAMP技术 环介导等温扩增法(loop mediated isothermal amplification , LAMP ) ,是一种在恒定温度下实现核酸的指数级扩增的技术 已经被用来快速检测动物病原(病毒、细菌、寄生虫) LAMP技术因其特异、敏感、简便、快捷、检测方式对实验室基础设施、设备的要求较少，逐步用于结核分枝杆菌诊断鉴别中 世界卫生组织于2016年8月11日，在日内瓦发布了一份最新的推荐书，推荐发展中国家的基础医疗单位使用该方法，可以作为痰涂片检测方法的替代方案 2 安徽省胸科医院安徽省结防所 2020年7月26日星期日 “十三五”规划要求逐步推广的新诊断技术 3 安徽省胸科医院安徽省结防所 2020年7月26日星期日 LAMP技术的原理 对靶基因的6个特异部位设定4种引物，利用具有链置换活性的BstDNA聚合酶在恒温条件下催化新链合成，从而使靶基因高效、快速、特异地扩增。 4 安徽省胸科医院安徽省结防所 2020年7月26日星期日 LAMP法使用的酶 链置换型DNA聚合酶: Bst DNA Polymerase 扩增对象为双链DNA时，其中一条链解离的同时进行链延长。 LAMP法使用最适温度65℃的聚合酶。 5 安徽省胸科医院安徽省结防所 LAMP法的引物设计 6 安徽省胸科医院安徽省结防所 LAMP法的原理 7 安徽省胸科医院安徽省结防所 LAMP法的原理 8 安徽省胸科医院安徽省结防所 LAMP技术特点 灵敏度高 LAMP一般能检测到比PCR低10倍的拷贝数，扩增模板可低至每测试10拷贝或更少。 特异性强 通过4对引物与靶序列上的6个特异部位准确结合 来产生扩增效应,因此能获得比PCR更高的特异性。 速度快 恒温扩增反应,没有PCR反应中温度变化的耗时,省却温度循环，在30min～60min内即可完成反应过程。 设备简单 只需一个简单的恒温器,不需要昂贵的PCR仪。 产物检测便捷 在合成DNA的同时产生的大量焦磷酸根离子,与镁 离子结合生成白色的焦磷酸镁沉淀，从而能定性判断LAMP反应；可与荧光物质结合。 9 安徽省胸科医院安徽省结防所 2020年7月26日星期日 LAMP法和其他PCR法的比较 10 安徽省胸科医院安徽省结防所 LAMP法和其他PCR法的比较 11 安徽省胸科医院安徽省结防所 LAMP法所需的试剂 12 安徽省胸科医院安徽省结防所 LAMP技术简介 环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification,LAMP）是由日本研究人员发明的一种新型的体外等温扩增特异核酸片段的技术。该技术可以在等温条件下（约65℃）进行核酸扩增反应，克服了传统PCR反应需要通过反复的热变性过程获得单链模板的缺点，从而实现在恒温条件下进行连续快速的核酸扩增，并且可以通过简易直观的目测判读结果，相比传统PCR大大节省了时间和实验操作步骤。 13 安徽省胸科医院安徽省结防所 LAMP法常规操作步骤 14 安徽省胸科医院安徽省结防所 LAMP法的检测方法 琼脂糖凝胶电泳法 由LAMP原理可知，LAMP反应的最终扩增产物是茎环DNA组成的混合物，即有若干倍茎长度的茎环结构和类似花椰菜的结构。因此，LAMP扩增产物在2％的琼脂糖凝胶糖上呈现的是典型的梯状条带。（图A） 肉眼观察法 在LAMP反应过程中，可以通过产生的副产物焦磷酸镁白色沉淀的产生来肉眼直接判断扩增反应是否进行。（图B） 通过荧光染料检测 有时，通过肉眼观察白色沉淀来检测会存在一定的误差，所以也可通过添加荧光染料，如溴化乙锭(EB)、SYBR GreenI等进行染色，来检测扩增是否发生。（图C） 15 安徽省胸科医院安徽省结防所 16 安徽省胸科医院安徽省结防所 LAMP法在结核菌检测中的应用 靶标限定: 结核分枝杆菌复合群 gyrB基因作为结核分枝杆菌重要的功能基因，在复合群进化过程中非常保守，LAMP法检测即以gyrB基因作为靶标。 临床上感染人类的是结核分枝杆菌复合群，包括结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、田鼠分枝杆菌、非洲分枝杆菌、卡氏分枝杆菌。 对检测对象的准确限定能避免