碧云天的突变试剂盒说明书.doc

基因定点突变试剂盒 产品简介: 碧云天生产的基因定点突变试剂盒(Site-directed Gene Mutagenesis Kit可 以用于点突变,多个邻近密码子的突变,单个或多个邻近密码子的缺失 (deletion或插入(insertion。 本试剂盒是一个利用目前最新的基因点突变技术设计而成的试剂盒。只 需通过基于PCR的突变质粒的合成,和基于Dpn I的模板质粒的消化,转 化培养以及后续的酶切或测序鉴定,即可得到预期的突变质粒(参考图 1。累计操作时间不足2小时即可完成基因的定点突变。 参考图1,使用本试剂盒时需要先设计长度通常为30个碱基以上的互补的 两个引物,在引物中含有预期的突变位点。然后以待突变的质粒为模 板,用这两个引物进行PCR扩增反应。这样可以产生含有预期的突变位 点的双链质粒,但这个双链质粒中有两个nick位点。待突变的质粒通常来 源于大肠杆菌等细菌,在细菌中会被甲基化修饰,而在体外通过PCR扩 增得到的质粒不会被甲基化。这样用甲基化酶Dpn I处理,可以消化掉待 突变的质粒模板,而使通过PCR扩增出来的含有突变位点的质粒被选择 性地保留下来。这样把Dpn I处理过的产物转化细菌后,质粒中有两个 nick位点可以被大肠杆菌修复,得到的克隆就会含有预期的突变质粒了。 本试剂盒提供了DH5α甘油菌,可用于感受态细菌的制备。 本试剂盒共可以进行十次基因定点突变反应。图1. 基因定点突变试剂盒原理图 保存条件: -20℃保存,一年有效。 注意事项: 需自行配制LB液体培养基和LB平板以用于细菌的培养。 需自行设计和合成用于基因定点突变的引物。需自备用于细菌转化的试剂。 使用本试剂盒前请先阅读后面的常见问题。 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。 使用说明: 1. 引物设计: 用于特定基因突变的引物需要单独设计,请参考如下一些基本原则进行设计: (1 共需设计两条互补的引物。可以先集中设计一条,然后就可以得到互补的另一条引物。 (2 引物的长度通常为25-45个碱基。 (3 引物中突变位点任何一侧都必需满足 4X(GC碱基数+2X(AT碱基数 ≥45。但引物也不宜过长,否则通常会形成非常 稳定的二级结构。通常把突变位点两侧的碱基数控制在15个左右,且使两侧按照上述计算得到的数值相近。 例如引物为agtcaggccaattcg aag cagtcgaattgccaag,其中蓝色的aag为突变位点,则 左侧:4X(GC碱基数+2X(AT碱基数=4X8+2X7=46≥45 右侧:4X(GC碱基数+2X(AT碱基数=4X8+2X8=48≥45 (4 在可能的情况下,尽量把引物的GC含量控制在40%-60%。 (5 在可能的情况下,尽量使引物不要产生非常稳定的二级结构和引物二聚体。二级结构和二聚体可以通过一些软件进行 分析。 (6 最好使用经过PAGE纯化的引物或更高纯度的引物。 2. 引物的配制: 如果合成得到的一个引物A的量是20nmol,另外一个互补引物B的量是19nmol。在引物A中加入200微升水,配制成浓度为100μM,在引物B中加入190微升水也配制成浓度为100μM。吸取20微升100μM引物A和20微升100μM引物B到一新的离心管中,再加入160微升水,混匀后即可得到可以直接用于基因定点突变反应的引物(10μM each。 3. 待突变模板质粒的选择: 选择GC含量在40-55%的待突变模板质粒,并且每一个50bp左右的局部GC含量最好也不超过70%。如果GC含量过高,请先把目的基因克隆到其它合适的载体上,再进行基因定点突变反应。另外目的基因GC含量最好也在40-55%的范围,并且每一个50bp左右的局部GC含量最好也不超过70%。如果目的基因GC含量过高,而突变位点不在高GC含量区域,可以先把该基因的不含高GC含量的一个区域克隆出来,进行定点突变,然后再把突变后的片断克隆回原基因中。如果必需使用高GC含量的质粒模板,或者有局部高GC含量的质粒模板,请另外使用专门用于高GC含量模板的PCR反应试剂。 必需使用从dam+的大肠杆菌(这类菌中质粒可以被甲基化中抽提得到的质粒用于基因定点突变。常用的大部分大肠杆菌都是dam+的,包括DH5α、JM109等。 4. 基因定点突变反应: (1 如下设置基因定点突变反应体系: Nuclease-Free Water ?μl Reaction Buffer (10X 5μl 引物 (10μM each 2μl dNTP Mix (2.5mM each 4μl 待突变模板质粒(0.5μg ?μl 总体积 49μl 按照上面的顺序依次加入各种试剂。在上述反应体系中,根据待突变模板质粒的量,计算出需加入的Nuclease-Free Water 的量,使