酵母和大肠杆菌细胞的破碎及破碎率的测定.docVIP

酵母和大肠杆菌细胞的破碎及破碎率的测定 一、实验原理 1.超声波破碎细胞的实验原理 频率超过15～20kHz的超声波，在较高输入功率下（100～250W），通过超声波发生器和换能器的作用, 将电能转换为声能，震动波通过浸入在样品中的钛合金变速杆对破碎的各类细胞产生空化效应，从而起到破碎细胞等物质的作用。 2.采用紫外分光光度法测定蛋白质含量的实验原理 蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质溶液在270～280nm具有一个紫外吸收高峰。在一定范围内，蛋白质溶液在最大吸收波长处的吸光度与其浓度成正比，服从朗伯比尔定律。由于不同蛋白质中酪氨酸和色氨酸的含量及所处的微环境不同，故蛋白质溶液在280nm的吸光度值不同。 3.血球计算板使用原理 计数区的刻度有两种：一种是计数区分为16个大方格，而每个大方格又分成25个小方格；另一种是一个计数区分成25个大方格，而每个大方格又分成16个小方格。但是不管计数区是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即计数区都由400个小方格组成。 a.16格×25格的血球计数板计算公式: 细胞数/ml=100小格内细胞个数/100×400×10000×稀释倍数 b. 25格×16格的血球计数板计算公式: 细胞数/ml=80小格内细胞个数/80×400×10000×稀释倍数 二、实验流程图 1.啤酒酵母的破碎 啤酒酵母培养（菌种纯化、扩大培养）→破碎前计数（采用紫外分光光度计测OD280定性检测蛋白）→细胞超声破碎（80 ml酵母细胞悬浮液置于100 ml容器中，浸没超声发射针1 cm ；频率中档超声4 s，间歇6 s，80-120次；0.5 ml悬液稀释1000倍，电子显微镜观察、计数；另取1.5 ml酵母破碎液12000 r/min 4 ℃离心10 min取上清，紫外分光光度计测OD280定性检测蛋白的释放情况；留取50ul上清加入2×SDS上清缓冲液，煮沸5 min，-20 ℃保存，待下次实验用。 2.大肠杆菌细胞的破碎 啤酒酵母培养（菌种纯化、扩大培养）→破碎前计数定性检测蛋白→细胞超声破碎（80 ml酵母细胞悬浮液置于100 ml容器，浸没超声发射针1 cm；频率中档超声4 s，间歇5 s，80次；取1.5 ml细胞悬浮液12000 r/min 4 ℃离心2 min取上清，紫外分光光度计测OD280定性检测蛋白的释放情况；留取50 ul上清加入 2×SDS上清缓冲液，煮沸5 min，-20 ℃保存，待下次实验用。 三、实验结果 酵母 0 60 80 100 120 140 160 细胞剩余个数（m） mOD280 蛋白浓度 大肠杆菌 0 60 80 100 120 140 160 mOD280 蛋白浓度 四、实验分析