96孔板法用于高通量血管紧张素转化酶抑制剂体外检测.docxVIP

PAGE1 / NUMPAGES1 96孔板法用于高通量血管紧张素转化酶抑制剂体外 检测 摘要为在体外迅速检测血管紧张素转化酶抑制剂（ACEI）的抑制活性，选用96孔板，以呋喃丙烯酰三肽（FAPGG）为模拟底物，通过检测血管紧张素转化酶（ACE）酶解FAPGG生成N\2?脖奖?氨酸（FAP）和双甘氨肽（GG）后340 nm处吸光值的下降衡量ACE的活性，采用加入ACEI前后ACE的活性变化衡量ACEI的活性。考察了不同缓冲体系、Cl－浓度、ACE酶活性（ACE酶浓度）、缓冲体系的pH值等对上述检测模型反应体系的影响，建立了高通量降血压肽活性体外检测方法，本方法最多可同时检测96个样品的ACE抑制活性，上机分析时间仅需10 s。不同批次活性平行测定的相对标准偏差均小于0.001%，p＝0.667＞ 0.05，各测定结果无显著差异，重现性好，精密度较高。采用本方法测定了商品血管紧张素转化酶抑制剂Captopril的IC50值为16.19 nmol/L，与文献报道的测定结果一致。 关键词高通量，血管紧张素转化酶抑制剂，活性检测 1引言 人体内的血管紧张素转化酶（ACE, EC3.4.15.1）催化血管紧张素I生成血管紧张素II，后者是强烈的血管收缩剂和肾上腺皮质类醛甾酮释放的激活剂[1]。血管紧张素转化酶抑制剂（ACEI）可以通过抑制血管紧张素II的生成，在人体内起到调节血压的作用[2，3]。 目前，ACEI活性检测主要包括体外检测和体内检测（动物降血压试验）。体外检测模型简单，快速、准确，重复性高，在初期的研究和工艺筛选过程中，往往使用体外检测[4]。因此，选择一种快速高效、准确可靠的体外检测方法是ACEI类药物研究过程中要首先解决的问题。 体外检测方法的检测原理：通过加入血管紧张素Ⅰ的模拟底物，在一定条件下与ACE作用，产生具有特异吸收特性的物质。通过检测加入ACEI前后这种物质吸收特性的差异，计算该物质对ACE的抑制率[4，5]。 常用血管紧张素Ⅰ的模拟底物有马尿酰组氨酰亮氨酸（HippurylLhistidylLleucine，HHL）和呋喃丙烯酰三肽N\Lphenylalanylglycylglycine，FAPGG）。ACE可酶解HHL生成马尿酸（Hippuric acid, HA）和二肽 （HistidylLleucine）。用于检测ACEI抑制效果的常用方法是利用紫外比色法检测添加ACEI前后HA生成量变化[1]，但需要先提取出马尿酸，操作繁琐，耗时，检测结果误差难以控制。许多研究者对这一方法进行了改进，利用HPLC或高效毛细管电泳等方法定量检测马尿酸[3，4]，无须提取步骤，提高了检测的准确性，灵敏度和重现性也较好，但样品前处理及检测过程耗时，需消耗大量有机溶剂或缓冲溶液，检测成本较高。 Holmquist等[5]建立了一种ACE活性检测方法，利用FAPGG作为ACE作用的底物，将其水解成FAP（N\2?脖奖?氨酸）和GG（双甘氨肽）。这些肽类的释放会减少FAPGG在预期波长的吸光度。文献\的方法与之类似。Vermeirssen等[8]在该方法的基础上建立了ACEI活性检测方法。与文献\相比，省去了乙酸乙酯萃取步骤，操作简单，快速准确，适用于ACE抑制剂的大规模快速检测。Vermeirssen等[9]利用此方法对几种商品ACE抑制剂进行实验，ActisGoretta[10]和Murray [11]等对该方法进行了不同程度的改进。但是这些方法都是基于分光光度法，试剂用量大，检测周期长、检测成本较高。 本研究采用微量法直接测定ACEI活性，省去了萃取步骤，简化实验操作，用96孔板代替传统的比色皿，用酶标仪代替紫外分光光度计，试剂用量少，大幅提高了检测速度和精密度，建立了一种方便快捷、试剂用量少、经济实用的检测方法。 2实验部分 2.1仪器、试剂与材料 PHS3C精密pH计（上海精密科学仪器有限公司）；CARY100紫外扫描分光光度计（美国瓦里安公司）；MSS全波长酶标仪（美国热电公司）；Avanti TMJ25高速冷冻离心机（美国BecKman仪器有限公司）；SPX250B生化培养箱（常州国华电器有限公司）。 血管紧张素转化酶（ACE, EC3.4.15.1），参考了文献\的方法，自猪肺中提取；FAPGG, FAP, GG, HEPES（羟乙基哌嗪乙磺酸）, Captopril（商品ACEI）和HHL，购自Sigma公司；其它化学试剂均为国产分析纯。 2.2实验方法 2.2.1 ACE活性检测FAPGG最大吸收峰在340 nm附近，用ACE将FAPGG水解成FAP和GG，FAPGG的水解使340 nm附近处吸光度降低，降低的速率与ACE活性成正比，通过测定FAPGG在340 nm附近处吸光度下降速度可计算出ACE的