4.1酶活性测定有哪些方法.pdf

酶活性测定有哪些方法 Progress curve of a typical enzyme reaction 定时法 (又称固定时间法，取样法，两点法) 定义：通过测定酶反应开始后某一时间内产物或底物浓度 的总变化量来求酶反应初速度的方法： (如：比色法介绍的方法) 优点：a.简单 b.测定时酶反应已终止，无需保温 c.显色 剂选择时无需考虑对E活性的影响 缺点：测定可存在误差，须经预试验了解，反应v呈线性 的时间, 实际测定工作中少见呈线性 定时法可能引起的误差 A.两点间呈线性 （少见） B.线性期短，大部分 ∵测定不够准确， 实际测得平均v 为非线性(最常见) 结果偏低 C.包括了延滞期 D.包括延滞期和非线性部分 定时法可能引起的误差示义图 [P] A D C B t0 t t 连续监测法： 定义：连续 (间隔15”~1’)测定酶反应过程中某一反应产物 或底物浓度随时间的变化来求酶反应初速度的方 法 — 动力学方法, 速率法 优点：动态了解反应v,易区分零级和一级反应期及延滞期 缺点：a.测定时需保温 b.检测有限制：△被测物S与P间理化特性要有差异 △显色剂对酶活性无影响 保温装置 注意： ①连续监测法测定包括了: 延滞期、线性期、非线性期 (动态期)v 平衡期v 动态定量描述：早期称动态法 ②速度计算; a.线性期，初v符合米氏方程的变量关系 Vm [S] v , Vm kp [E] v k [S]0 0 0 Km+[S] b.非线性期，v不能简单地按米氏方程的计算，它 是表观速度 (Vapp)或称反应净速度 ∵存在逆反应 动 态 期 平 衡 期 延滞期 线性期 非线性期 [P] t 实际酶测定时的时间进程曲线图 表观速度 (Vapp)or称反应净速度 Vm [S]-常数 V app Ks+[S]+常数 ③由于酶偶联技术的应用连续监测法的应用范围得以 大大地扩展(无需S、P