超氧化物歧化酶的活性测定.pdfVIP

精品文档 超氧化物歧化酶的活性测定 超氧化物岐化酶 (Superoxide dismutase ，简称 SOD)广泛存在于生物体内的含 Cu、Zn、 Mn、 Fe 的金属类酶。它作为生物体内重要的自由基清除剂，可以清除体内多余的超氧阴离 子，在防御生物体氧化损伤方面起着重要作用。离子 (O2 - ) 是人体氧代谢产物，它在体内过 量积累会引起炎症、 肿瘤、色斑沉淀、衰老等疾病， 超氧阴离子与生物体内许多疾病的发生 和形成有关。 由于 SOD能专一消除超氧阴离子 (O2 - ) 而起到保护细胞的作用， SOD作为一种药 用酶，具有广阔的应用前景，并引起了国内外医药界、生物界和食品界的极大关注。 按金属辅基成分的不同可分成 3 种类型。 最常见的一种含有铜锌金属辅基 (CuZn-SOD)，主要 存在于真核细胞的细胞质中， 在高等植物的叶绿体基质、 类囊体内以及线粒体膜间隙也有存 4 在， CuZn-S0D酶蛋白的分子量约为 3.2 ×10 ，纯品呈蓝绿色，每个酶分子由 2 个亚基通过非 共价键的疏水基相互作用缔合成二聚体。 每个亚基 ( 肽链 ) 含有铜、 锌原子各一个， 活性中心 的核心是铜。 第二种含有锰离子 (Mn-SOD)，主要存在于真核细胞的线粒体和原核细胞中， 在 植物的叶绿体基质和类囊体膜上也有存在， 纯品呈粉红色， 由 4 条或 2 条肽链组成。 第三种 是 Fe-S0D，过去一直认为只存在于原核细胞中，近来发现有一些真核藻类甚至某些高等植 物中也有存在。 Fe-SOD纯品呈黄色或黄褐色，由 2 条肽链组成，多数情况下每一个二聚体 中含有一个 Fe 原子。 [ 原理 ] SOD的活力测定方法很多，常见的有化学法、免疫法和等电点聚焦法。其中化学法应用 最普遍， 化学法的原理主要是利用有些化合物在自氧化过程中会产生有色中间物和 O2- ，利 用 SOD分解而间接推算酶活力。在化学方法中，最常用的有黄嘌呤氧化酶法，邻苯三酚法， 化学发光法，肾上腺素法， NBT-还原法，光化学扩增法， Cyte 还原法等。其中改良的邻苯 三酚自氧化法简单易行较为实用。化学发光法和光化学扩增法不适用于测定 Mn-SOD，但对 于 Cu/Zn-SOD 反应极灵敏。 Cyte 还原法用于 Mn-SOD活力测定结果稳定，重复性好。但专一 性和灵敏度不够理想，而且需要特殊仪器，实际应用受到限制。亚硝酸盐形成法与 CN—抑 制剂或 SDS处理相结合， 应用于 Mn-SOD测定， 灵敏度比 Cyte 还原法提高数倍， 而且专一性 强，重复性好，操作方便，不需要特殊仪器和设备，易于实际应用和推广，是目前较好的测 定方法之一。 在一般情况下， SOD酶活性测定只能应用间接活性测定法。本实验采用邻苯三酚自氧化 方法。 邻苯三酚在碱性条件下，能迅速自氧化，释放出 O2 - ，生成带色的中间产物，反应开始 后反应液先变成黄棕色， 几分钟后转绿， 几小时后又转变成黄色， 这是因为生成的中间物不 断氧化的结果。 这里测定的是邻苯三酚自氧化过程中的初始阶段， 中间物的积累在滞留 30 ～ 45s 后，与时间成线性关系，一般线性时间维持在 4min 的范围内，中间物在 420nm 波长出 有强