大肠杆菌感受态细胞的制备和转化原理和操作步骤.pdfVIP

1.概 述 在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主 ,但在人工构建的质粒载 体中,一般缺乏此种转移所必需的 mob 基因,因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的 接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取 外源 DNA。 转化(Transformation)是将外源 DNA 分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段, 它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。转化过程所用的受体细 胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ,Mˉ),它 可以容忍外源 DNA 分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方法(如电 击法,CaCl2 ,RbCl(KCl)等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为 能允许外源 DNA 分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。进入受体细胞的 DNA 分子 通过复制,表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在 筛选培养基中培养，即可筛选出转化子 (Transformant, 即带有异源 DNA 分子的受体细胞)。 目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2 和 RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制备的感受态细胞 转化效率较高,但 CaCl2 法简便易行,且其转化效率完全可以满足一般实验的要求,制备出的 感受态细胞暂时不用时,可加入占总体积 15％的无菌甘油于-70℃保存(半年),因此 CaCl2 法 为使用更广泛。 为了提高转化效率, 实验中要考虑以下几个重要因素： 1. 细胞生长状态和密度: 不要用经过多次转接或储于４℃的培养菌，最好从－70℃或-20℃ 甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期 时为好，可通过监测培养液的OD600 来控制。DH5α 菌株的OD600 为 0.5 时,细胞密度在 5×1 07 个/ml 左右(不同的菌株情况有所不同),这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。 2. 质粒的质量和浓度: 用于转化的质粒 DNA 应主要是超螺旋态 DNA(cccDNA)。转化效率 与外源 DNA 的浓度在一定范围内成正比,但当加入的外源 DNA 的量过多或体积过大时,转 化效率就会降低。1ng 的 cccDNA 即可使 50μl 的感受态细胞达到饱和。一般情况下,DNA 溶液的体积不应超过感受态细胞体积的 5 ％。 3. 试剂的质量: 所用的试剂,如 CaCl2 等均需是最高纯度的(GR.或 AR.),并用超纯水配制最, 好分装保存于干燥的冷暗处。 4. 防止杂菌和杂 DNA 的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行, 所用器皿, 如离心管, tip 头等最好是新的,并经高压灭菌处理,所有的试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、DNA 酶或杂 DNA 所污染, 否则均会影响转化效率或杂 DNA 的转入, 为以后的筛选、鉴定带来不 必要的麻烦。本实验以 E.coli DH5a 菌株为受体细胞,并用 CaCl2 处理,使其处于感受态,然 后与 pBS 质粒共保温,实现转化。由于 pBS 质粒带有氨苄青霉素抗性基因(Ampr )，可通过 Amp 抗性来筛选转化子。如受体细胞没有转入 pBS，则在含Amp 的培养基上不能生长。 能在 Amp 培养基上生长的受体细胞（转化子）肯定已导入了 pBS。转化子扩增后，可将转 化的质粒提取出，进行电泳、酶切等进一步鉴定。本实验以 E.coli DH5a 菌株为受体细胞, 并用 CaCl2 处理,使其处于感受态,然后与 pBS 质粒共保温,实现转化。由于 pBS 质粒带有 氨苄青霉素抗性基因(Ampr )，可通过Amp 抗性来筛选转化子。如受体细胞没有转入 pBS， 则在含 Amp 的培养基上不能生长。能在Amp 培养基上生长的受体细胞（转化子）肯定已 导入了 pBS。转化子扩增后，可将转化的质粒提取出，进行电泳、酶切等进一步鉴定。 2. 材料、设备及试剂 一. 材料 E. coli DH5α 菌株: Rˉ,Mˉ,Ampˉ；pBS 质粒 DNA: 购买或实验室自制，eppendorf 管。 易生物试剂库 /yp/product