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基因定点突变方法及其应用 摘要：本文综述了基因定点突变的三种方法，在此基础上的一些改进 方法及其应用，并对这三种方法进行了比较。 关键词：定点突变；寡核苷酸引物；PCR；盒式突变 Methods of Site-directed Mutagenesis and Their Application Abstract: In the paper，methods of site-directed mutagenesis ，some advanced methods on the basic methods and their application are present. At the same time ，the comparison are made . Key words: site-directed mutagenesis；oligonucleotide ；PCR ；cassette mutagenesis 定点突变技术可以随心所欲地在已知 DNA 序列中取代、插入或 缺失一定长度的核苷酸片段。该方法比使用化学因素、自然因素导致 突变的方法具有突变牢高、简单易行、重复性好的特点；除用于改变 核苷酸序列获得突变基因、研究基因的结构与功能的关系之外，还能 够通过改变特定的氨基酸获得突变蛋白质，研究蛋白质的结构与功能， 从微观水平上阐明正常状态下基因的调控机理、疾病的病因和机理。 随着分子生物学研究的突飞猛进，基因定点突变技术成为一项重要的 分子生物学实验技术手段，在生物和医学领域中的应用非常广泛。目 前常用的定点突变方法有寡核苷酸引物介导的定点突变、PCR 介导的 [1] 定点突变及盒式突变等 。 1 常用定点突变方法 1.1 核苷酸引物介导的定点突变 其原理是用含有突变碱基的寡核苷酸片段作引物，在聚合酶的作 用下启动 DNA 分子进行复制。主要的过程(见图 1)：①将待突变基因克 隆到突变载体上；②制备含突变基因的单链模板；③引物与模板退火 5 ’端磷酸化的突变寡核苷酸引物，与待突变的核苷酸形成一小段碱 基错配的异源双链的 DNA，④合成突变链：在 DNA 聚合酶的催化下， 引物以单链 DNA 为模板合成全长的互补链，而后由连接酶封闭缺口， 产牛闭环的异源双链的 DNA 分子；⑤转化和初步筛选异源双链 DNA 分子转化大肠杆菌后，产生野生型、突变型的同源双链 DNA 分子。 可以用限制性酶切法、斑点杂交法和生物学法来初步筛选突变的基因； ⑥对突变体基因进行序列分析。 1.2 PCR 介导的定点突变 经典 PCR 介导的定点突变法，需要 4 种扩增引物，进行 3 次 PCR 反应(见图 2) 。头两次 PCR 反应中，应用两个互补的并在相同部位具 有相同碱基突变的内侧引物，扩增形成两条有一端可彼此重叠的双链 DNA 片段，去除未参入的多余引物之后，这两条双链 DNA 片段经变 性和退火可以形成具有 3 ’凹末端的异源双链分子，在TaqDNA 聚合 酶的作用下，产生含重叠序列的双链 DNA 分子。这种 DNA 分子再用 两个外侧寡核苷酸引物进行第三次 PCR 扩增，便产生突变体 DNA。 1.3 盒式突变 盒式突变是利用一段人工合成的含基因突变序列的寡核苷酸片 段，取代野生型基因中的相应序列。这种突变的寡核苷酸是由两条寡 核苷酸组成的，当它们退火时，按设计要求产生克隆需要的粘性末端， 由于不存在异源双链的中间体，因此重组质粒全部是突变体。如果将 简并的突变寡核苷酸插入到质粒载体分子上，在一次的实验中便可以 获得数量众多的突变体，大大减少了突变需要的次数。这对于确定蛋 白质分子中不同位点氨基酸的作用是非常有用的方法。 2 定点突变方法的改进 2.1 寡核苷酸引物介导的定点突变的改进 该方法常产生突变效率低的现象，其主要原因是大肠杆菌中存在 甲基介导的碱基错配修复系统所致。针对这一问题，KUNKEL[2]进行了 改进，用尿嘧啶取代 DNA 的选择作用提高了突变效率。近几年来， 多家生物公司又进行了进一步的完善，并相继推出了本公司的产品。 据不完全统计：Promega 公司研制了 Alter sites Ⅱin vitro Mutagenesis system ，安法玛西亚公司研制了 Unique Site Elimination Mutagenesis Kit，Stratagene 公司研制了 Quik