海洋来源放线菌次级代谢产物及抗农业病原真菌活性研究.pdfVIP

符 号 说 明 HPLC: high performance liquid chromatography, 高效液相色谱法 16S rRNA: 16S ribosomal ribonucleic acid, 16S 核糖体核糖核酸 RFLP: Restriction fragment length polymorphism, 限制性内切酶片段长度多态性 DNA: Deoxyribonucleic acid, 脱氧核糖核酸 PCR: Ploymerase chain reaction, 聚合酶链式反应 13C-NMR : Carbon nuclear magnetic resonance, 碳-13 核磁共振 1H-NMR : Proton nuclear magnetic resonance, 氢核磁共振 DEPT: Distortionless enhancement by polarization transfer, 无畸变极化转移技术 MIC: Minimum inhibitory concentration, 最小抑菌浓度 目录 中文摘要I Abstract III 1 前言 1 1.1 海洋放线菌 1 1.1.1 放线菌概述 1 1.1.2 放线菌的分类及鉴定 2 形态特征观察 2 化学分类 2 分子分类 3 1.1.3 海洋放线菌的来源、种类及分布 3 海底沉积物中的放线菌 4 海洋动植物共附生的海洋放线菌 5 海水中的放线菌 6 1.1.4 极地海洋环境来源放线菌 6 1.2 农业病原菌 7 1.2.1 黄瓜枯萎病菌 7 1.2.2 黄瓜霜霉病 8 1.2.3 黄瓜白粉病 8 1.2.4 芦笋茎枯病菌 8 1.3 放线菌研究方法与发展历程 9 1.3.1 传统培养方法 9 1.3.2 分子生物学技术 9 1.3.3 其他技术 10 1.4 海洋活性物质在农业领域应用现状 10 1.4.1 国外研究现状 10 1.4.2 国内研究现状 10 1.5 研究意义及研究内容 11 1.5.1 研究意义 11 1.5.2 研究内容 12 1.6 技术路线 12 2 材料与方法 13 2.1 仪器设备 13 2.2 实验试剂 13 2.3 实验方法 15 2.3.1 样品来源 15 2.3.2 培养基的配制 15 分离培养基 15 保存培养基 16 发酵培养基 17 检定菌培养基 17 优化培养基 18 2.3.3 土壤样品处理 19 2.3.4 培养基的制备 19 2.3.5 菌株的分离与纯化 20 2.3.6 菌株的保藏 20 2.3.7 菌株DNA 提取与16S rDNA 基因的PCR 扩增和序列分析 20 DNA 提取 20 16S rDNA 基因的PCR 扩增及凝胶电泳 20 2.3.8 序列测定和系统进化树的构建 21 2.3.9 发酵粗提物制备 22 2.3.10 HPLC 分析 22 2.3.11 抗菌活性的测定 22 2.3.12 确定目标菌株 23 2.3.13 基于OSMAC 策略的初步发酵条件探索与优化 23 2.3.14 发酵液的粗提取、HPLC 分析、抗菌活性测定 23 2.3.15 添加微量稀土元素和氨基酸进一步优化发酵条件 23 2.3.16 最佳发酵条件确定与大田试验验证 24 2.3.17 最适条件下的扩大发酵 24 2.3.18 化合物的分离纯化 24 2.3.19 化合物的结构确定与活性实验 24 2.3.20 化合物的最小抑菌浓度测定 24 3 结果与分析 26 3.1 放线菌在不同培养基及样品中的分布 26 3.2 多样性分析 28 3.3 抗菌活性筛选结果 31 3.4 HPLC 液相分析结果 38 3.5 确定目标菌株 44 3.6 基于OSMAC 策略的初步发酵条件确定 44 3.7 添加微量元素，确定最佳发酵条件 46 3.8 大田试验 47 3.9 化合物的分离 48 3.10