2材料和方法新的新的[文档].pdfVIP

实用标准文案 2 材料和方法 2.1 实验材料及处理 植物材料种植在山东农业大学温室内， 温度为 25 ±4℃，光照强度约为 800 -2 -1 μmolm s ，相对湿度 75%左右。以野生型番茄 （Lycopersicon esculentum ） 品种“中蔬 4 号”，T2 代（ T1 代纯合子）转正、反义 LeGPAT基因番茄植 株 T2-5(+) 、T2 -19(+) 、和 T2-2(-) 、T2-16(-) 为试材。种子浸种催芽 5d 生根后分别播于直径 15cm、高 10 cm 的塑料盆中， 蛭石作基质， Hoagland 营养液培养， 放置于温室中生长。 番茄生长至 8 片真叶时用于低温逆境处 理，于处理后选取最上部完全展开叶进行光合、荧光参数测定和 D1 蛋白 修复的测定。或于处理后取叶片，液氮冷冻，保存于 -70 ℃用于活性氧产 生、抗氧化酶活性等测定。 49 2.2 转基因番茄植株的 PCR检测 2.2.1CTAB 法微量法提取基因组 DNA 1、取 0.1-0.2 g 新鲜叶片，置液氮中研磨成粉，转移到 1 .5 ml 离心管 中，加入 1 ml 2 ×CTAB提取缓冲液， 轻轻搅动， 使粉末充分散开， 于 65℃ 水浴中保温 20 min 。 2、随后， 4 ℃，10000 rpm 离心 10 min 。 3、上清液转入一新离心管中，加入 500 μl 氯仿/ 异戊醇（ 24:1 ），轻轻混 匀，放置 5 min 。 4 、4 ℃，8 000 rpm 离心 10 min 。 5、将上清液转入另一离心管中，加入 500 μl 冷的异丙醇，混匀， 4 ℃放 置 10 min 。 6、4 ℃，8 000 rpm 离心 10 min，去掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上。 7、75%乙醇洗沉淀，置超净工作台中 20 min 吹干。 8、加入 50 μl TE 溶解 DNA，-20 ℃保存备用。 2 ×CTAB提取缓冲液 (100 ml) ：取 1M Tris.Cl 10 ml ；0.5 M EDTA 4ml ； NaCl 8.182 g ；CTAB2.0 g；PVP 3.0 g 。将上述成分用蒸馏水溶解后，定 精彩文档 实用标准文案 溶到 1 00 ml 。灭菌后加入加β - 巯基乙醇 200 μl ，备用。 2.2.2 转基因植株的 PCR筛选 用 CTAB微量法提取转基因番茄叶片中的总 DNA，以此为模板，用合成的 引物进行 PCR。 正向筛选引物均以 PBI 和 GP6为引物；反向筛选引物均以 PBI 和 GP5为引 物。 1、反应体系如下： PCR buffer 5 μl MgCl2 4 μl dNTP 1μl PBI 1 μl GP5/GP6 1μl DNA 1μl TaqE 0.5 μl ddH2O 36.5 μl Total 50 μl 2、反应程序如下： 94℃预变性 8 min 94℃变性 50 s 35 个循环 48 ℃退火 30 s 72℃延伸 90 s 72℃后延伸 5 min 取 PCR产物 10 μl ，进行琼脂糖凝胶电泳检测。 2.3 转基因番茄叶片膜脂含量的测定方法 2.3.1 、脂类的提取：参照 Siegenthaler 等（ 1989）的方法。 精彩文档 实用标准文案