草鱼鱼肉抗氧化肽的制备、分离鉴定及其活性研究.pdfVIP

摘 要 本论文以草鱼鱼肉为原料，通过单因素实验确定了制备高抗氧化活性酶解产 物的最佳可控酶解工艺，然后使用交联葡聚糖凝胶G-25 （Sephadex G-25 ）对酶 解产物进一步纯化并利用Nano-LC-ESI-Q-Orbitrap-MS/MS 对目标组分中肽段的 序列进行鉴定，筛选出符合抗氧化肽特征的肽段进行合成并对其抗氧化活性进行 验证，同时研究了抗氧化肽间的协同作用，以期为其在保健食品中的应用提供一 些理论依据。 （1）以水解度和抗氧化能力为评价指标，通过单因素实验优化了复合蛋白 酶-碱性蛋白酶二步酶解制备草鱼鱼肉酶解物（GCHs ）的条件，并对酶解产物的 + - 2+ 体外抗氧化活性（ABTS· 清除能力，O · 清除能力和Fe 螯合能力）和氨基酸组 2 成进行了分析。结果表明，固定复合蛋白酶酶解条件，碱性蛋白酶二步酶解的最 优条件为：料液比，4% ；pH ，9.0 ；酶添加量，6000 U/g；酶解温度，50 ℃；酶 解时间，2 h 。在此条件下制得的酶解产物富含疏水性氨基酸和酸性氨基酸，且其 + - 2+ ABTS· 和O · 清除能力以及Fe 螯合能力的IC 值分别为0.21、5.60、2.47 mg/mL 。 2 50 （2 ）通过测定GCHs 的分子量分布，并采用活性跟踪手段结合Sephadex G- 25 色谱柱对GCHs 进行纯化，然后通过Nano-LC-ESI-Q-Orbitrap-MS/MS 技术对 目标肽段的氨基酸序列进行鉴定。结果表明，GCHs 主要由小分子多肽组成，分 子量分布在5400 Da 以下，经Sephadex-G25 纯化后共得到五个组分，其中组分 + - 3 （F3 ）具有最强的ABTS· 清除能力和O · 清除能力，其IC 值分别为0.11 和 2 50 0.47 mg/mL ，比纯化前分别提高了1.91 和11.91 倍。从F3 中鉴定出26 条平均局 部置信度得分（ALC ）≥ 95%的寡肽的结构，并通过抗氧化肽的结构特征筛选出 15 条抗氧化肽。 + - （3 ）通过测定合成的15 条抗氧化肽的ABTS· 清除能力、O · 清除能力以及 2 DPPH·清除能力验证其抗氧化活性，并分析其协同作用。结果表明，结构为 + - WEPPR 、VAGW 、LLPDDGDH 的寡肽分别具有最强的DPPH· 、ABTS· 和O · 清 2 除能力，其GSH 当量值分别为324.83、139.77、529.06 µmol GSH/mg 。肽段氨基 + - 酸组成中的Trp、Tyr、Pro 、Arg 等对ABTS· 和DPPH· 的清除贡献较大，而O · 2 的清除则可能与 Asp 有较大