产志贺毒素大肠埃希氏菌标志性毒力基因对X快速检测与分型法的建立.pdfVIP

摘要 产志贺毒素大肠埃希氏菌 （Shigatoxin-producingEscherichia coli，STEC） 作为食源性致病菌中的一种，其致病能力极强，被感染者容易形成出血性结肠炎 或血性腹泻，严重者可进一步发展为溶血性尿毒综合征，危及生命。STEC广泛 分布于生活环境中，在食品制作、加工、包装以及运输过程中极易感染此菌。建 立一种快速、简便的产志贺毒素大肠埃希氏菌检测与分型方法有助于更好地开展 食品安全的检测，进一步降低STEC 的感染风险。 本研究利用不对称聚合酶链式反应 （AsymmetricPolymeraseChain Reaction， aPCR）结合免疫层析技术 （Immu-nochromatographicAssay，ICA），快速检测 并准确分型产志贺毒素大肠埃希氏菌STEC 标志性毒力基因stx，主要内容和结 果如下： 首先，建立快速检测STEC标志性毒力基因stx 的方法。利用不对称PCR 技 术分别制备生物素标记的stx1和stx2 目标基因单链DNA，该扩增产物与红色聚 苯乙烯微球标记的stx1和stx2 目的基因上游引物特异性结合，结合物上的生物 素基团与免疫层析试纸条上的链霉亲和素特异性结合而显色，实现对STEC标志 性毒力基因stx 的检测。对检测条件进行优化，结果显示：stx1不对称PCR 体系 中 stx1F:Biotin-stx1R 最佳引物浓度 比为 1:7 ，stx2 不对称 PCR 体系 中 stx2F:Biotin-stx2R 则为 1:4，不对称PCR 最佳循环次数为55，最佳退火温度为 55℃，stx1与stx2 的最佳引物加入量均为3 μL （Biotin-stx1R 与Biotin-stx2R 浓度 均为2 μM），标记物聚苯乙烯微球最佳封闭剂为1%的BSA，最优加入量为20 μL。 利用所建立的方法能准确地检测出含有stx 基因的STEC，且对不含stx 基因的菌 株显示阴性检测结果，具有良好的检测特异性。 其次，建立快速分型stx1和stx2 的方法。利用双重不对称PCR（Duplex aPCR） 制备地高辛标记的stx1 目标基因单链DNA 与生物素标记的stx2 目标基因单链 DNA，该扩增产物与被红色聚苯乙烯微球标记的stx1和stx2 目标基因上游引物 特异性结合，结合物上的地高辛和生物素分别与试纸条上的抗地高辛抗体和链霉 亲和素特异性结合并显色，根据不同检测线的显色情况，判断菌株所携带的不同 类型的stx 基因。对检测条件进行优化，结果显示：双重不对称PCR 体系中 stx1F:Digoxin-stx1R 与stx2F:Biotin-stx2R 引物浓度最佳比例皆为 1:6，最佳循环 次数为45，最佳退火温度为59℃，stx1 与stx2 的最佳引物加入量均为3 μL （Digoxin-stx1R 与Biotin-stx2R 浓度均为2 μM），标记物聚苯乙烯微球的最佳 I 封闭剂为Seablock，最适加入量为50 μL。利用该方法对不同stx 基因型的STEC stx1 stx2 菌株进行检测，结果显示该方法能够准确地分型检测 与 基因。 最后，利用本实验建立的stx 基因分型检测法对20株菌株进行stx 基因的检 STEC stx 测与分型，结果显示该方法可准确地检测出含有 标志性毒力基因 的菌 株并实现准确分型。该方法对于非产志贺毒素菌株呈现阴性检测结果。具有选择 性高且快速、准确和安全的优点，结果判定便利、直观，可实现现场快速检测的 目的，适合基层实验室使用。 关键词：不对称聚合酶链式反应；免疫层析技术；产志贺毒素大肠埃希氏菌； 检测；分型 II Abstract Shiga toxin-producing Escher