生化分离与纯化技术 凝胶色谱法分离蛋白质 凝胶色谱法分离蛋白质.pptVIP

LOGO 凝胶色谱法分离蛋白质 细胞色素C的制备 产品简介 1 实训目标 2 实训原理 3 实训试剂与设备 4 生产实训 5 产品检测 6 产品简介 一、产品简介 名称：细胞色素C 英文名称:Cytochrome C 别名：细胞色素丙、细丙 分子量：11000-13000，12400 二、产品药理作用 1、呼吸链中的作用 本品为生物氧化过程中的电子传递体。其作用原理为在酶存在的情况下，对组织的氧化、还原有迅速的酶促作用。通常外源性细胞色素C不能进入健康细胞，但在缺氧时，细胞膜的通透性增加，细胞色素C便有可能进入细胞及线粒体内，增强细胞氧化，能提高氧的利用。 细胞色素C的制备 产品简介 细胞色素C是一种细胞色素氧化酶，是电子传递链中唯一的外周蛋白，位于线粒体内侧外膜。 2、诱导细胞凋亡 有关细胞凋亡的研究表明，细胞色素C与细胞凋亡有关，从线粒体中泄露出的细胞色素C有诱导细胞凋亡的作用。 细胞色素C的制备 实训目标 1.掌握凝胶色谱基本原理。 2.熟悉凝胶色谱法的操作。 3.了解物质在色谱柱中洗脱行为 与分配系数的关系。 细胞色素C的制备 凝胶颗粒 实训原理 细胞色素C的制备 实训试剂与设备 一、试剂和材料 市售新鲜猪心、三氯乙酸溶液、氢氧化钠、硫酸铵、葡聚糖凝胶G-25、葡聚糖凝胶G-100 二、实验器材 组织匀浆捣碎机、数显恒温磁力搅拌器、冷冻高速离心机、抽滤装置、LKB柱层析系统、三用电热恒温水箱 细胞色素C的制备 生产实训 一、生产前准备 1、检查生产原料、各种生产用试剂；2、检查生产设备；3、检查生产记录等文件 二、生产操作 1、细胞色素C粗品的制备 （1）预处理 以猪心为材料制成肉糜，按1g肉糜加入1 m L 0.145mol/ L的三氯乙酸溶液，使p H=4，室温下置3h后，于4000r/min离心15min，收集上清液，将沉淀重复抽提1~2次，（每次lh），合并提取液，用氢氧化钠调至pH=7.3。 细胞色素C的制备 生产实训 （2）细胞色素C粗品的制备 硫酸铵盐析：在上面收集的提取液中，加入固体硫酸铵（使溶液硫酸铵的饱和度为45％）边加边搅拌，放置30分针后，杂蛋白便从溶液中沉淀析出，而细胞色素C仍留在溶液中，用滤纸（或离心）除去杂蛋白，即得红色透亮细胞色素C溶液。 三氯醋酸沉淀：在搅拌情况向所得透亮溶液加入20％三氯醋酸(2.5m1三氯醋酸/100m1细胞色素C溶液)，细胞色素C立即沉淀出来（沉淀出来的细胞色素C属可逆变性），立即于3000转/分钟离心15分钟，收集沉淀。加入少许蒸馏水，用玻棒搅拌，使沉淀溶解。 细胞色素C的制备 生产实训 2、脱盐与纯化 （1）脱盐 将葡聚糖凝胶G-25用沸水浴溶胀2h后，冷却后装入LKB柱层析系统 (柱管为φ2.7m、长6 4.5cm ) 中.将粗样品溶于少量无离子水中，加样时检查床表面平整后，将柱的出口打开，使床表面的洗脱液（无离子水）至表面以上2mm关闭柱的出口。将LKB层析柱表面的尼龙布移至柱床表面1mm处，缓慢注入样品液3~5cm，打开柱的出口，使样品渗入凝胶内.样品加完后，用无离子水作为洗脱液，以小体积的洗脱液，洗表面1~2次，当样品将流干时，象加样时一样，仔细地加入洗脱液.当洗脱液渗入表面时，即可开始层析.由微量泵控制流速1mL/min收集红色部分。用奈氏试剂或乙酸钡溶液检查收集液无铵离子或硫酸根离子，将收集液浓缩后再走第二根柱。 细胞色素C的制备 生产实训 （2）纯化 第二根层析柱柱管(柱管为φ2.7m、长6 4.5cm )葡聚糖凝胶为葡聚糖凝胶G-100，沸水浴溶胀5h,冷却后装柱.洗脱液为无离子水.加样方法同上.微量泵控制流速1mL/min收集红色部分即为纯化的细胞色素C 。 细胞色素C的制备 产品检测 所得制品是还原型细胞色素C水溶液，在波长520nm处有最大吸收值，根据这一特性，用721型分光光度计，先作出一条标准细胞色素C浓度和对应的光密度值的标准曲线，然后根据测得的待测样品溶液的光密度值就可以由标准曲线的斜率求出待测样品的含量。 细胞色素C的制备 产品检测 一、检测前准备 1、检测装置、各种检测用试剂 2、检查检测记录等文件 二、产品检测 1、标准曲线的绘制： 取1毫升标准品(81mg/ml)，稀释至25ml，从中分别取0.2，0.4，0.6，0.8，1.0ml，分别置于五支试管中，每管补加蒸馏水至4m1，并加少许联二亚硫酸钠作还原剂，然后在520nm处测得各管的光密度，分别为0.179，0.330，0.520，0.700，0.870。以浓度为横坐标，光密度值为纵坐标，作出标准曲线图，从图中求得斜率 细胞色素C的制备 产品检测 2、样品测定取ml样品，稀释适当倍数，再加少许联二亚硫酸钠，在波长520nm处测定光密度。最后根据标准曲