腹腔巨噬细胞吞噬功能检测方法.docxVIP

PAGE1 / NUMPAGES1 在机体的免疫过程中，巨噬细胞(MF)承担着噬菌、杀菌、清除机体内被损伤和朽迈的细胞，以及传递抗原信息;MF将捕获的抗原进行加工处理后，把降解的抗原信息传递给T、B淋巴细胞。MF又是天然杀伤细胞(NK细胞)的激活剂，且对B淋巴细胞的激活、增殖和分化具有调节作用。实验目的掌握巨噬细胞(MF)体外吞噬异物能力的测定方法，观察机体的非特异性免疫现象。实验原理巨 在机体的免疫过程中，巨噬细胞(MF)承担着噬菌、杀菌、清除机体内被损伤和朽迈的细胞，以及传递抗原信息;MF将捕获的抗原进行加工处理后，把降解的抗原信息传递给T、b淋巴细胞。MF又是天然杀伤细胞(NK细胞)的激活剂，且对B淋巴细胞的激活、增殖和分化具有调节作用。 实验目的 掌握巨噬细胞(MF)体外吞噬异物能力的测定方法，观察机体的非特异性免疫现象。 实验原理 巨噬细胞(MF)在机体的非特异性免疫中具有严重作用，其吞噬异物的能力在一定程度上反映了机体免疫水平的凹凸。本实验采用测定小鼠腹腔MF吞噬鸡红细胞的吞噬百分率和吞噬指数，来评价免疫抑制剂环磷酰胺(CYP)对机体免疫状态的抑制作用。 实验用品 一、材料 1.小白鼠6~10只，随机分为二组。 2. 5%鸡红细胞悬液： 用已灭菌的注射器，自康健鸡的翼下静脉采血1ml，放置于5倍体积的Alsever“s溶液中。4℃条件下可保存一周。使用时用灭菌的生理盐水洗涤3遍(2000r/min，每次5min)，然后用生理盐水配成5%的浓度。 二、试剂 1. Alsever“s溶液 葡萄糖 2.05g 柠檬酸三钠(Na3C6H5O7·2H2O) 0.89g 氯化钠 0.42g 溶解后加蒸馏水至100ml，用柠檬酸(C6H8O7·H2O)调pH至 7.2，超滤除菌或 6.6′104Pa(10磅)灭菌20min，保存4℃冰箱备用。 2. Hank’s液 (1)贮存液(药品全部用AR试剂)， 甲液: ①NaCl80g,MgSO4·7H2O 1g,MgCl2·6H2O 1g，用双蒸馏水定容至450ml。 ②CaCl2 1.4g双蒸馏水定容至50ml。 将①、②液混合，加氯仿1ml。 乙液: Na2HPO4·l2H2O 1.52g，KH2PO4 0.6g,酚红 0.2g,葡萄糖l0g,用双蒸馏水定容至500ml,加氯仿lml。 (2)应用液: 贮存液甲: 贮存液乙: 双蒸馏水=1:1:18。 6.6′104Pa (10磅)灭菌20min。4℃保存可使用1个月。临用前，用 3.5%的NaHCO3调pH至 7.2。 3. 0.9%生理盐水(灭菌) 4. Giemsa染液 (1)贮存液: 称取Giemsa粉 0.5g研细，再将33ml甘油逐滴加入，继续研磨至无颗粒。80℃水浴过夜，然后加入33ml甲醇。置棕色瓶中，于56℃放置24h后即可使用。 (2)应用液: 临用时取贮存液lml加l0ml pH 7.4磷酸缓冲液，混匀后过滤。 5.甲醇 6.肝素钠溶液: 用灭菌生理盐水配制。每20IU 0.1ml可抗凝1ml全血。 7. 0.6%环磷酰胺溶液: 用灭菌生理盐水配制。 三、设备 保温箱、显微镜、带盖解剖盘.医用剪刀、镊子、刻度离心管及试管架、载玻片、滴管、酒精及碘酒棉球、擦镜纸、称量纸及滤纸。 实验方法 实验前二天，给实验组小鼠腹腔注射 0.6%的环磷酰胺( 0.2ml/只)对照组小鼠注射灭菌生理盐水↓每只小鼠注射pH 7.2的Hank液2m1 (腹腔注射时进针切忌过深，针头方向最佳向后，以免伤其内脏，使血管破损出 血，影响实验取材)↓实验当天给小鼠腹腔注射5%鸡红细胞 0.5ml/只 ↓2~3h后 脱颈法处死小鼠立即由腹腔注入lml生理盐水 ↓轻揉小鼠腹部约lmin，剪开腹部皮肤,肌肉层上开口 滴管伸入腹腔吸出腹腔液，置于滴有肝素钠的离心管中混匀↓把腹腔液滴加在洁净的载玻片上↓将载玻片置于带盖解剖盘中(盘底部放2~3盒湿沙布) ↓37℃培养箱孵育30min 取出玻片，漂洗去上清液和末粘附在玻片上的细胞 (漂洗标准: 在显微镜下检查无重叠细胞层，且水流不要过急以免将贴附在玻片 上的MF冲掉) ↓室温下晾干或用吹风机吹干载玻片 Giemsa染液染色5~l0min↓冲洗去多余染液，晾干↓高倍镜或油镜下观察并计数计算出吞噬百分率和吞噬指数 [附]： 吞噬百分率=吞噬鸡红细胞的MF数/MF总数′l00 吞噬指数= MF吞噬的鸡红细胞总数/吞噬鸡红细胞的MF总数