生物化学基础 核酸的性质 核酸-性质.ppt

第三节 核酸及核苷酸的性质;一般理化性质;一、核酸的水解;酸或碱水解;酶水解;二、核酸的酸碱性质;;;2、核苷的解离 戊糖可增强碱基的酸性解离 核糖中的羟基也可发生解离 3.核苷酸的解离 磷酸基使核苷酸具有很强的酸性 由于核苷酸含有磷酸与碱基,为二性电解质，它们在不同酸碱度的溶液中解离程度不同，在一定条件下可成为兼性离子。;;核酸的碱基、核苷、核苷酸均能发生解离，因此核酸是两性电解质。 核酸的两性电离主要决定于磷酸基和含氮碱基 DNA等电点为4～4.5； RNA等电点为2～2.5 ;三、核酸的紫外吸收;紫外吸收性质 ;;OD260的应用： 1. DNA或RNA的定量 OD260=1.0相当于 50μg/ml双链DNA 40μg/ml单链DNA（或RNA） 20μg/ml寡核苷酸 2.判断核酸样品的纯度 DNA纯品: OD260/OD280 = 1.8 RNA纯品: OD260/OD280 = 2.0 含杂蛋白及苯酚，降低 3.判断DNA是否变性;四、核酸的变性、复性与杂交;核酸的变性：在某些理化因素作用下（温度、酸碱、有机溶剂、尿素等），核酸分子互补双链之间氢键断裂，使双螺旋结构松散变成单链的过程。变性产生增色效应。 变性表征： 生物活性部分丧失、粘度下降、浮力密度升高、紫外吸收增加（增色效应） 变性因素： pH（11.3或5.0）变性剂（脲、甲酰胺、甲醛） 低离子强度、加热 ;; 某些理化因素破坏了氢键和碱基堆积力， 使核酸分子高级结构改变、理化性质及 生物活性发生改变。 不涉及磷酸二酯键断裂，一级结构不变。;降解：核苷酸骨架上3’，5 ’-磷酸二酯键的断裂; 高温（一般＞75℃）— 热变性 强酸、碱 — 酸碱变性 甲醛（Agarose中RNA ） 尿素（PAGE中DNA ） 甲醛用于琼脂凝胶电泳，测RNA分子大小；尿素用于聚丙烯酰胺凝胶电泳中作变性剂，测定DNA序列。; OD260增高 粘度下降 比旋度下降 浮力密度升高 酸碱滴定曲线改变 生物活性丧失;完全变性后核酸紫外吸收值增加： 天然DNA 25－40%、RNA 约1.1% 实质：碱基暴露;5、DNA热变性的特征; 指增色效应达50%时的温度 一般DNA Tm 值在85 - 90 ?C之间;（1）DNA的均一性： （2）G－C含量： 经验公式： XG+C＝（Tm－69.3）×2.44 （3）介质中的离子强度： ;(二)核酸的复性（renaturation）;退火温度＝Tm－25℃ 复性影响因素: 片段浓度/片段大小/片段复杂性（重复序列数目）/溶液离子强度 ;;DNA复性;DNA片段分子量越大复性越难； DNA浓度越大，复性越容易； DNA复性也与它本身组成和结构有关 （具有很多重复序列DNA，复性快）。 减色效应（低色效应） ——;(三)核酸的杂交;杂交：不同来源的核酸经变性和复性的过程，其中一些不同的核苷酸单链由于存在局部碱基互补片段，而在复性时形成杂化双链，此过程称分子杂交。 包括 DNA—DNA 杂交 DNA—RNA 杂交 RNA—RNA 杂交 原因：不同核酸的碱基之间可以形成碱基配对. 用途：是分子生物学研究与基因工程操作的常用技术.;DNA-DNA 杂交双链分子;特别提示;特别提示;（2）存在部位不同： DNA：主要存在于细胞核中；RNA：主要存在于细胞质中（胞液中）。;（3）结构不同： DNA：一级结构是多聚脱氧核糖核苷酸链中脱氧核糖核苷酸的连接方式、数量和排列顺序。二级结构为双螺旋结构，三级结构为超螺旋结构，四级结构是DNA与蛋白质形成复合物。 RNA：一级结构是多聚核糖核苷酸链中核糖核苷酸的排列顺序。RNA分子为单链结构，大多为线状单链，某些区域可自身回折珙成局部双螺旋。发夹结构是RNA最普通的二级结构，二级结构进一步折叠形成三级结构（成为有活性的分子），RNA也能与蛋白质形成核蛋白复合物，四级结构是RNA与蛋白质相互作用的结果。 ;（功能不同）： DNA：遗传基因的载体，主要的遗传物质。 RNA：与蛋白质生物合成有关。 mRNA：传递DNA的遗传信息，指导蛋白质的生物合成。 tRNA：在蛋白质生物合成中转运氨基酸、识别密码子。 rRNA：与蛋白质结合为核糖体，构成蛋白质合成的场所。