（优质课件）实时荧光定量PCR数据分析及常见问题分析.pptVIP

二、常见问题分析 手动设置基线 设置完成后问题曲线恢复正常 * 二、常见问题分析 3、重复性 1个样本4个复孔重复性好 * 二、常见问题分析 3、重复性 1个样本4个复孔重复性差 * 二、常见问题分析 造成重复性差的原因 基线、阈值的设置 加样误差（操作？移液器？） 没有将试剂和样本充分混匀 低拷贝的样本→泊松分布 没有使用ROX校准（ABI7500） * 二、常见问题分析 基线、阈值的设置 根据曲线的具体情况进行设置： 阈值：大部分曲线荧光强度/20 基线：开始→2/3（根据仪器和试剂） 结束→扩增信号出现的前一个循环 如果基线、阈值设置无问题，则是其它原因造成重复性差。 * 二、常见问题分析 加样误差（操作？移液器？） 没有将试剂和样本充分混匀 有时候在制备PCR反应混合液时（包括Goldstar/PCR Mix反应液、引物探针、样本、水），在分装入反应板（管）前没有充分混匀。 结果加入到每个孔中的试剂成分就有所不同。 解决方法： 在分装反应混合液前，要将其充分混匀（振荡、吹打）离心。 同时上机之前，要将PCR反应板（管）离心，使所有液体都在反应管底部。 * 二、常见问题分析 低拷贝的样本→泊松分布 泊松分布：是一种统计与概率学里常见到的离散机率分布（discrete probability distribution）。 在30ul中有9个模板，每个反应管均匀的分配到3个模板的几率有多高？如果30ul中有9000个模板呢，又会怎么样？ * 二、常见问题分析 ROX校准：参比荧光（ABI7500） * 二、常见问题分析 ROX设置 ABI7500仪器软件自动进行ROX校准。 ROX校准为可选步骤，如果使用的PCR试剂没有添加ROX参比荧光，或者ROX添加浓度不适合，请将ROX校准关闭（None）。 * 二、常见问题分析 4、“可疑的” 扩增曲线（以ABI7500为例） 由于PCR扩增形成的真正的扩增曲线通常很容易确认。 有特征的形状：首先有背景信号（基线期），然后是三个增长阶段（指数增长期、线性增长期和平台期） * 二、常见问题分析 指数增长期内扩增曲线具有高度重复性 * 二、常见问题分析 是什么原因造成平台期很低呢？ 可能是目标样本的浓度太低。 通常如果模板的起始浓度太低，反应体系中会形成大量的引物二聚体。 大量引物二聚体的形成使得引物很快消耗完，从而造成扩增曲线的平台期很低。 * 二、常见问题分析 引物和模板比例 * 二、常见问题分析 是否可以调整引物和模板的比例？ YES。 低引物浓度会导致高Ct值（灵敏度低）。 所以对于低浓度的样本，反应体系中引物的浓度却不能太低。 * 二、常见问题分析 如何判断他们是否存在扩增？ 首先看对数图谱，和同一反应中的其它曲线相比，这些曲线的形状不相同。 * 二、常见问题分析 如何判断他们是否存在扩增？ 同时这些曲线没有明显的指数增长期。 * 二、常见问题分析 如何判断他们是否存在扩增？ 最后看线性图谱。 曲线一直没有上升的趋势，提示不存在扩增。 * 二、常见问题分析 如何判断他们是否存在扩增？ 案例： 先看对数图谱 右侧的曲线形状和扩增曲线很相似，但曲线不光滑。 * 二、常见问题分析 如何判断他们是否存在