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分子生物学基础实验 指导老师:肖靓  分子生物学基础实验 分子生物学实验技术已成为生物化学及分子生物学 以及相关学科院系教学科研不可缺少的一部分。为 提高学生在分子生物学技术方面的动手能力,分子 生物学实验室主要开设常用而基本的分子生物学实 验技术。它的内容包括质粒DNA的制备;DNA的重 组;PCR基因扩增等等。  实验要求 上课时间与纪律:严格遵守老师的安排。 实验室内禁止饮食、勿高声谈话、随意 走动。 ■课前预习、课中认真操作、课后的实验 报 妥善保管好每组的实验器具。 实验操作要求人人动手。 值日制度:每天五位同学。  质粒DMA小量制备的实验原理 要把一个有用的外源基因通过基因工程 手段,送进细胞中去进行繁殖和表达, 需要运载工具,携带外源基因进入受体 细胞的这种工具就叫载体( vector) 载体的设计和应用是DNA体外重组的重要 条件。  作为基因工程的载体必须具备下列条件 是一个复制子,载体有复制点才能使与它结合的外源 基因复制繁殖。 载体在受体细胞中能大量增殖,只有髙复制率才能使 外源基因在受体细胞中大量扩增。 载体DNA链上有1到几个限制性内切酶的单一识别与切 割位点,便于外源基因的插入。 载体具有选择性的遗传标记,如有抗四环素基因 (Tcr),抗新霉素基因(Ner)等,以此知道它是否已 进入受体细胞,也可根据这个标记将受体细胞从其他 细胞中分离筛选出来 细菌质粒具备上述条件,它是基因工程中常用的 载体之  质粒( plasmid)是一种染色体外的稳定遗传 因子,大小在1-120kb之间,具有双链闭合 环状结构的DNA分子,主要发现于细菌、放线 菌和真菌细胞中。质粒具有自主复制和转录 能力,能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数, 可表达它携带的遗传信息。它可独立游离在 细胞质内,也可以整合到细菌染色体中,它 离开宿主的细胞就不能存活,而它控制的许 多生物学功能也是对宿主细胞的补偿。  质粒在细胞内复制的两种类型 ■严密控制型( stringent control):质粒只在细胞周期的 定阶段进行复制,染色体不复制时,它也不复制。每个 细胞内只含有1个或几个质粒分子。 ■松弛控制型( relaxed control):质粒在整个细胞周期中 随时复制,在细胞里,它有许多拷贝,一般在20个以上 通常大的质粒如F因子等,拷贝数较少,复制受到严格控制。小的质粒,如 CoI质粒(含有产生大肠杆菌素E1基因),拷贝数较多,复制不受严格控 制。在使用蛋白质合成抑制剂一氯霉素时,染色体DNA复制受阻,而松弛型 Co!EI质粒继续复制12-16h,由原来20多个拷贝可扩增至1000-3000个拷贝 此时质粒DNA占总DNA的含量由原来的2%增加到40%-50%。本实验分离提纯 化的质粒pBR322、pUC19就是由CoEI衍生的质粒  分离质粒DNA的三个基本步骤 培养细菌使质粒扩增; 收集和裂解细菌 分离和纯化质粒DNA。 釆用溶菌酶可破坏菌体细胞壁,十二烷基硫酸钠(SDS) 可使细胞壁解,经溶菌酶和阴离子去污剂(SDS)处理 后,细菌染色体DN缠绕附着在细胞壁碎片上,离心时 易被沉淀出来,而质粒DNA则留在清液中。用乙醇沉淀、 洗涤,可得到质粒DMA。  收非细胞 细菌培养 1,悬浮细菌沉淀 2.加入溶菡酶 3.加入去污剂/NaOH 1.用KAc中和,并高心 质粒,tRNA,一些蛋白质 蛋白质,色体DNA 取上清液,酚一氧仿抽提 变性蛋白质 水溶(质粒+RNA) 取水溶滚,乙醇 正溶解 勤相 DN沉淀 纯化的质粒  质粒DNA的相对分子量一般在106-107范围内,如质粒 pBR322的相对分子质量为2.8×106,质粒pUC19的相对 分子质量为1.7×106。 在细胞内,共价闭环DNA( covalently close circular dna,简称cNA)常以超螺旋形式存在 如果两条链中有一条链发生一处或多处断裂,分子就 能旋转而消除链的张力,这种松弛型的分子叫作开环 DNA( open circular dNA,简称 OCDNA)。在电泳时, 同一质粒如以 cccDNA形式存在,它比其开环和线状DNA 的泳动速度快,因此在本实验中,自制质粒DNA在电泳 凝胶中呈现3条区带。