分子生物学实验技术汇编.pptVIP

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2020-08-30 发布于福建
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分子生物学实验技术汇编.ppt

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第一章RNA的提取和cDNA的合成 RT-PCR原理及应用提取总RNA 反转录 CDNA 作模板 PCR 获得目的基因应用:基因检测、基因转录产物的分析、合成DNA探针、构建RNA高效转录系统、RNA的提取口RNA易降解,在提取过程中要严格防止RNA酶的污染,并设法抑制其活性口RNA酶稳定,并广泛存在,如各种组织、人的皮肤、手指、试剂、容器等。采取的措施: 1、全部实验过程中均需戴手套操作并经常更换(使用一次性手套)。 2、所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中200℃C烘烤2小时以上。 3、不能用高温烘烤的材料如塑料容器、试剂等可用 0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC水溶液处理,然后高压灭菌以消除残存的DEPC。注意事项: 1、DEPC与氨水溶液混合会产生致癌物。 2、DEPC能与胺和巯基反应,因而含Trs和DTT 二硫苏糖醇)的试剂不能用DEPC处理。 3、Tris溶液可用DEPC处理的水配制然后高压灭菌。 4、配制的溶液如不能高压灭菌,可用DEPC处理水配制,并尽可能用未曾开封的试剂。总RNA提取方法(试剂盒): 异硫氰酸胍-苯酚法( Trizol法) 原理:首先用强变性剂异硫氰酸胍裂解细胞,同时使核蛋白复合体中的蛋白变性,释放出核酸。释放出来的DNA和RNA由于在特定pH时溶解度不同,分别位于整个体系中的中间相和水相,从而使DNA和RNA分离开来。进一步通过有机溶剂来抽提沉淀RNA,就可以得到纯净的RNA。二、cDNA的合成 5× Buffer 4ul dNtPs 6 RNA酶抑制剂 luI Oligo(dT) lul 随机引物 1ul 反转录酶AMV 1ul 提取的RNA 6ul 总体积 20ul RhA 5·引物 ↓玩转录两 T山 KNA-DNA杂交体 ↓RNAH ↓DNA聚合酶双佐DNA 口反转录酶:依赖于RNA的DNA聚合酶种类:两种 1、禽类成髓细胞病毒(AMV)反转录酶包括两个多肽亚基(最适温度42c) 活性:依赖于RNA的DNA合成,依赖于DNA的 DNA合成以及对DNA:RNA杂交体的RNA部分进行内切降解(RNA酶H活性)。 2、鼠白血病病毒(MLV反转录酶只有单个多肽亚基(最适温度37C) 活性:依赖于RNA和依赖于DNA的DNA合成活性, 但降解 RNA DNA杂交体中的RNA的能力较弱, 且对热的稳定性较AMv反转录酶差。 MLV反转录酶能合成较长的cDNA(如大于2-3kb)。