土壤中微生物的分离纯化课堂.pptVIP

1 实验十二 土壤中微生物的分离及纯化 （设计性实验） 2 一、目的要求 1 、掌握倒平板的方法和几种常用的分离纯化微生物的 基本操作技术； 2 、初步观察来自土壤中的三大类群微生物的菌落形态 特征； 3 、学习平板菌落计数的基本原理和方法，并掌握其基 本技能。 3 二、基本原理 （一）土壤是微生物生存的大本营，所含微生物无论是数量还 是种类都是极其丰富的，原因是什么？ 由于土壤具备了各种微生物生长发育所需要的营养、水分、空气、 酸碱度、渗透压和温度等条件，所以成了微生物生活的良好环境。可以 说，土壤是微生物的“天然培养基”，也是它们的“大本营”因此，土 壤是微生物多样性的重要场所，是发掘微生物资源的重要基地，人们可 与从中分离、纯化获得许多有价值的菌株。 4 （二）如何分离？ 在土壤、水、空气或人及动、植物体中，不同种类的微生物绝大多数都是 混杂生活在一起，当我们希望获得某一种微生物时，就必须从混杂的微生物类 群中分离它，以得到只含有这一种微生物的纯培养，这种获得纯培养的方法称 为微生物的分离与纯化。 为了获得某种微生物的纯培养，一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧 等条件要求不同，而供给它适宜的培养条件，或加入某种抑制剂造成只利于此 菌生长，而抑制其他菌生长的环境，从而淘汰其他一些不需要的微生物，再用 稀释涂布平板法 或 平板划线分离法 等分离、纯化该微生物，直至得到纯菌株。 从微生物群体中经分离、生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。 因此，纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征 等综合考虑。有些微生物的纯培养要经过一系列的分离与纯化过程和多种特征 （产酸产气情况、染色情况、营养要求、氧气需求、酸碱度、渗透压和温度等） 鉴定方能得到。 从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过 程称为微生物的分离与纯化。 5 （三）平板菌落计数法的原理 将待测菌液经适当稀释，涂布在平板上，经过培养后在平板上形 成肉眼可见的菌落。统计菌落数，根据稀释倍数和取样量计算出样品 中细胞密度（一般选择每个平板上长有 50-200 个菌落的稀释度计算每 毫升的含菌量较为合适）。 由于待测样品往往不易完全分散成单个细胞，平板上形成的每个 菌落不一定是单个细胞生长繁殖而成，有的可能来自两个或多个细胞。 因此，平板菌落记数的结果往往比样品中实际细胞数低，这就是现在 使用 菌落形成单位 取代以前用绝对菌落数来表示样品活菌含量的原因。 该法虽然操作较繁琐，结果需要培养一段时间才能获得，而且测定结果 易受多种因素的影响，但是，由于该方法能直接反映样品中活细胞数量，所 以被广泛用于生物制品（如活菌制剂）、食品、饮料、水（包括水源水）以 及多类产品等质量检测与控制的标准方法。快速细菌自动稀释仪和自动菌落 计数仪则提供快速准确的结果。 6 培养基 的类型？ 7 三、实验器材 1 、土壤样品（自带） 2 、培养基：淀粉琼脂培养基（高氏 Ⅰ 号培养基），牛肉 膏蛋白胨琼脂培养基，马丁氏琼脂培养基。 3 、溶液和试剂： 10 ％酚，链霉素，盛 9ml 无菌水的试管， 盛 99ml 无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶。 4 、仪器和其他用品：无菌玻璃涂棒，无菌吸管，无菌培 养皿等。 8 四、操作步骤 1 、倒平板 ①标记，最好写在皿底边上，以防盖子盖错； ②加热熔化三种培养基，冷至 55 ～ 60 ℃ 时，在高氏 Ⅰ 号培养基中加入 10 ％酚数滴，马丁氏琼脂培养基中加入链霉素溶液（终质量浓度为 30ul/mg ），混匀后看清标记分别倒平板，在火焰附近，每皿倒 15 ～ 20ml ，静置凝固后备用； ( 若皿盖上冷凝水过多，最好用灭菌棉花或 灭菌纸擦后再涂布 ) 9 2 、稀释土样 制备土壤稀释液称取土样 10g ，放入盛 90ml 无菌水并带有玻璃珠 的三角烧瓶中，振摇约 20 分钟，使土样与水充分混合，将菌分散。用 一支 1ml 无菌吸管从中吸取 1ml 土壤悬液注入盛有 9ml 无菌水的试管中， 吹吸三次，使充分混匀。然后再用一支 1ml 无菌吸管从此试管中吸取 1ml 注入另一盛有 9ml 无菌水的试管中，以此类推制成 10 -1 、 10 -2 、 10 - 3 、 10 -4 、 10 -5 、 10 -6 各种稀释度的土壤溶液。 减小误差应注意的方面： ①称量准确； ②土样与水混合，一定要摇匀； ③每次稀释取液应换一支新的吸管； ④每次取液时应先混匀试管中的溶液； 10 各培养基涂布菌液时对稀释度的选择： 牛肉膏蛋白胨培养基 10 -4 、 10 -5 、 10 -6 ； 高氏一号培养基： 10 -3 、 10 -4 、 10 -5 ； 马铃薯培养基： 10 -2 、 10 -3 、 10 -4 ； 平板菌落计数法，所选择倒