细胞培养基本技术 南方医科大学.ppt

2 细胞培养用液的配制 水：新鲜配置的三蒸水或去离子水 平衡盐溶液：无 Ca 2+ 、 Mg 2+ 的缓冲液 PBS ： NaCl 8.0 g KCl 0.2 g Na 2 HPO 4 .H 2 O 1.56 g KH 2 PO 4 0.20 加水至 1000 ml ? 消化液： ? 胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞 间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。 ? ? 胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细 胞。 ? 胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无 Ca2+ 、 Mg2+ 的 PBS 缓冲液 配制常用的胰蛋白酶液浓度是 0.25 ％ 。用滤器过滤除菌。 ? 胰蛋白酶液消化时间： 2-10 分钟。 ? 用含血清培养液终止其对细胞的消化作用 培养基 ? 培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培 养基和合成培养基。 ? 天然培养基： ? 天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。 ? 优点：营养成分丰富，培养效果好 ? 缺点：来源受限。 ? 成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析。 ? 易发生支原体污染 合成培养基 ? 合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数 量，用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培 养基，如 TC199 、 MEM 、 RPMI-1640 、 DMEM 等。 ? 合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化 合物、无机盐和其它一些辅助物质。 ? 优点：标准化生产，组分和含量相对固定。 ? 成本低 ? 缺点： 缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生 长需要。 ? 人工合成培养基只能维持细胞生存， 要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量 的天然培养基（如血清）。 ? 血清中含有： ? ①多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等） ? ②多种金属离子 ； ③激素； ④促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等。 ? ⑤各种生长因子 ? ⑥转移蛋白 ? ⑦不明成分 ? 一般说来．含 5 ％小牛血清的培养基对大多数细胞可以维持细胞 不死．但支持细胞生长一般需加 10 ％血清． ? 对于血清支持细因生长的生物学效应已得到证明，但对血清中的 复杂成分至今尚未完全清楚． ? 血清中不仅存在促细胞生长因子，同对也存在细胞生长抑制因子 或毒性因子，因此在含血清培养基中培养的细胞所反映的生物学 特性是细胞和复杂血清因子的综合反应。 ? 在生长因子、蛋白质工程、基因表达调控等研究领域，迫切需要 用无血清培养基培养细胞． ? 无血清培养基的主要研制策略：在基础培养基中补充各种必需因 子，如激素、生长因子 、结合蛋白 、贴壁和扩展因子 等。 ? 无血清培养基由基础培养基和替代血清的补充成分组成。 ? 1975 年， Sato 首次成功地用无血清培养基培养了垂体细胞株，近 20 多年来已报道了几十种细胞系在无血清培养基中成功地生长和 增殖。 ? 无血清细胞培养基的使用保证了实验结果的准确性、可重复性和 稳定性，，减少了细胞污染，简化了提纯和鉴定各种细胞产物的 程序。 ? 向无清培养液中能促进细胞系生长的补加物都是独特的。适用于 某种细胞株的培养液，很可能不适合另一种细胞株的生长。即使 同源组织的不同细胞株，所需补加物也不同。 无血清培养基尚处于研究阶段，难以推广。 目前，绝大多数人工合成培养基使用时还需添加血清 ? 血清质量好坏是实验成败的关键。 ? 常用血清有胎牛血洁、新生牛血清、小牛血情、兔血 清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。 ? 优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、 支原体、病毒污染。 ? 血清的灭活（消除补体活性）： 56 ℃ ， 30 分钟 ? 血清的消毒：过滤除菌 ? 抗菌素的使用： ? 在培养液配制后，培养液内常加适量抗菌素，以 抑制可能存在的细菌的生长。 ? 通常是青霉素和链霉素联合使用。培养基内青霉 素、链霉素最终使用浓度为每毫升 100 单位。 ? 庆大霉素：每毫升 100 单位 —— 方便、广谱、稳 定 完全培养基的组成 ? 基础培养基 80 ％一 95 ％ ? 血清 5 ％一 20 ％ ? 碳酸氢钠 2.0 g/L ? 青、链霉素 各 100 卑位／毫升 培养基的配制 RPMI-1640 培养粉 1 袋 碳酸氢钠 2.0 g 青、链霉素 各 100 单位／毫升 加三蒸水 至 1000ml, 过滤除菌。 调节 pH 值至 7.2 加血清（终浓度 10 ％） 细胞培养基本技术 细胞培养的甚本概念 ? 传代： ? 细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种 到新的培养器皿中。 ? 原代培养 ? 取自体内新鲜组织并