实验一无菌关键技术及培养基的配制.docVIP

试验1 培养基制备、消毒灭菌倒平板（共6课时） 一、试验目标 1.了解配制培养基原理，并掌握配制培养基通常方法和步骤。 2.学习多个常见培养基配制、分装和灭菌操作方法. 二、试验器材 1.药品及试剂： 可溶性淀粉，KNO3，K2HPO4·3H2O，MgSO4·7H2O，FeSO4·7H2O，1mol/L NaOH，琼脂，牛肉膏，蛋白胨，NaCl，马铃薯 2.仪器及其它 试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻棒、天平、药匙、高压蒸汽灭菌锅、pH试纸(5.5-9.0) 、棉花、牛皮纸、记号笔、麻绳、纱布、干燥箱、培养皿、涂布棒、吸管（1ml）、玻璃珠、PH试纸 三、试验内容 1.分组配制高氏一号培养基300ml。 配方： 可溶性淀粉20g NaCl 0.5g、 KNO3 1g 、K2HPO4·3H2O 0.5g MgSO4·7H2O 0.5g FeSO4·7H2O 0.01g 琼脂 15-25g 水 1000ml pH 7.4-7.6 2.配制牛肉膏蛋白胨培养基100ml 配方： 牛肉膏3g 蛋白胨10g NaCl 5g 琼脂20g 水1000ml PH 7.4-7.6 3.配制马铃薯培养基100ml 配方： 马铃薯200g 蔗糖20g 琼脂20g 水1000ml pH自然 4.包扎材料：试管，培养皿，涂布棒，吸管，枪头盒等。 5.灭菌。 6.摆斜面，倒平板，放冰箱。 四、方法步骤 （一）培养基制备和分装 1.称量 按培养基配方百分比依次正确地称取药品。可溶性淀粉先用少量热水溶化后再加入其它成份，补足所需水分，混匀后加入琼脂。 2.熔化 在沸水浴锅中加热熔化。 3.调pH 用1mol/L NaOH调pH至7.4-7.6。 4.过滤 趁热用多层纱布过滤 5.分装 将溶化固体培养基趁热加至漏斗上，装试管时，注意管口不要沾上培养基。液体分装装量不超出试管1/4，固体分装装量不超出试管1/5，分装三角瓶量不超出三角瓶容积二分之一，半固体分装装量为试管1/3，灭菌后垂直待凝。 6.加棉塞 培养基分装完成后，在试管口或三角瓶口塞上棉塞，以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并确保有良好通气性能，然后包扎一层牛皮纸。试管应先捆成一捆后再于棉塞外包扎牛皮纸，贴上标签，注明培养基名称、日期、组别。 7. 为了确保试验顺利进行，要求把试验用器皿清洗洁净。保持灭菌后无菌状态，需要对培养皿、吸管等进行妥善包扎。试管和三角瓶要做棉塞。这些工作看来很一般，如操作不妥或不按要求要求去做，会造成试验失败。所以应看作是微生物试验基础操作。 （二）器皿包扎 为了灭菌后仍保持无菌状态，多种玻璃器皿均需洗净后包扎。 1、培养皿 洗净烘干后每10套迭在一起，用牢靠纸卷成一筒，外面用绳子捆扎，以免散开，然后进行灭菌。到使用时在无菌室中才打开取出培养皿。 2、吸管 洗净烘干后吸管，在口吸一端用尖头摄子或针塞入少许脱脂棉花，以预防菌体误吸口中，及口中微生物吸入管而进入培养物中造成污染。塞入棉花量要适宜，棉花不宜露在吸管口外面，多出棉花可用酒精灯火焰把它烧掉。每支吸管用一条宽约4~5厘米，以45°左右角度螺旋形卷起来，吸管尖端在头部，吸管另一端用剩余纸条迭打结，不使散开，标上容量。若干支吸管扎成一束，灭菌后，一样要在使用时才从吸管中间拧断纸条抽去吸管。（演示） 3、试管和三角瓶 试管和三角瓶全部要作适宜棉花塞。棉花塞作用是起过滤作用，避免空气中微生物进入试管或三角瓶。棉花塞制作要求使棉花塞紧贴玻璃壁，没有皱纹和缝隙，不能过松，过紧易挤破管口和不易塞入，过松易掉落和污染。棉花塞长度不少于管口直径二倍，约2/3塞进管口。若干支管用绳子扎在一起，在棉花塞部分外包，油纸或牛皮纸再在纸外用绳扎紧。三角瓶每个单独用油纸包扎棉花塞。（演示）。 （三）、高压蒸汽灭菌锅湿热灭菌。 高压蒸汽灭菌法高压蒸汽灭菌器装置严密，输入蒸汽不外逸，温度随蒸汽压力增高而升高，当压力增至103－206kPa时，湿度可达121.3-132℃ 操作方法： 1、在灭菌锅中盛蒸馏水直至高水位灯亮；将用试管分装好培养基、包装好培养皿等玻璃器械放入灭菌器内； 2、旋紧上盖，设定灭菌条件：103kPa，121.3℃，开始灭菌 3、加热，打开排气活门，放出冷空气（通常在水沸后排气5分钟左右），关闭放气活门，使压力逐渐上升至103kPa，温度达121.3℃，维持20分钟后，排气至压力显示“0 （四）、倒平板、摆斜面 1.灭菌完成，将试管培养基冷至50℃ 2.在超净工作台上将三角瓶中无菌培养基倒入无菌培养皿中（演示） 3.将灭菌培养基放入37℃ 4.将培养基放入4℃ 五、注意事项： 高压蒸汽灭菌法： 第一，无菌包不宜过大（小于50cm×30cm×30cm），不宜过紧，各包裹间要有间隙，使蒸