七叶树七叶皂苷合成途径中相关酰基转移酶候选基因的初步研究.pdfVIP

七叶树七叶皂苷合成途径中相关酰基转移酶候选基因的初步研究 七叶树七叶皂苷合成途径中相关酰基转移酶候选基 因的初步研究 摘要：七叶树 （Aesculus chinensis Bge.）又被称为娑罗树，为七叶树科七叶 树属落叶乔木，在中国分布广泛。七叶皂苷作为中药娑罗子主要活性成分，具 有极高的药用价值，可用于治疗脑出血、脑水肿、呼吸系统疾病等。七叶皂苷 是七叶树三萜类合成途径中十分重要的代谢产物，由原七叶皂苷元经多步糖基 化和酰基化而形成，后期的修饰直接关联到该化合物的药用活性。特别是酰基 转移酶参与的酰基化修饰，催化激活的酰基由供体转移至受体上。本研究基于 七叶皂苷 （A、B）在七叶树不同组织含量数据、转录组数据及同源类比分析， 筛选参与七叶皂苷合成途径中高表达酰基转移酶，对候选的酰基转移酶编码基 因进行表达分析和重组蛋白纯化，以揭示酰基转移酶在七叶皂苷合成途径中的 作用，为三萜类有效成分合成机制的阐明提供理论基础。本研究取得如下结果： 1.LC-MS定量分析七叶皂苷 （A、B）在七叶树不同组织含量 七叶皂苷 （A、B）在七叶树各组织中含量分布不均，主要分布于花和种子。 对花、种子中七叶皂苷A 含量数据进行t 检验，P0.01，种子中含量明显高于 花，两者差异极显著；对花、种子中七叶皂苷B 含量数据进行t 检验，P0.01， 种子中含量也明显高于花中的含量，两者差异极显著。根据七叶皂苷在不同组 织中的差异积累，推测转录水平的变化起到重要作用，因此利用转录组差异分 析可以筛选到高表达量酰基转移酶基因。 2.七叶皂苷合成途径中酰基转移酶相关基因的发掘、分析及鉴定 基于转录组差异分析，本研究利用同源进化分析，筛选出酰基转移酶候选 基因。最终成功克隆到11个酰基转移酶相关基因的全长序列，其中BAHD-ATs 类的有3个，SCPL-ATs类的有8个，它们分别为：AcBAHD 4、AcBAHD 25、 AcBAHD 26、AcSCPL 1、AcSCPL 7、AcSCPL 8、AcSCPL 9、AcSCPL 11、AcSCPL 15、AcSCPL 16、AcSCPL 17。 进一步采用qRT-PCR 检测它们在七叶树的转录情况，结果显示：AcBAHD 25，AcBAHD 26在七叶树种子中表达量最高，其次是花，差异极显著；而AcBAHD 4在七叶树花中表达量最高，种子中次之，差异极显著；而对于SCPL-ATs家族 I 七叶树七叶皂苷合成途径中相关酰基转移酶候选基因的初步研究 酰基转移酶基因，AcSCPL 7、AcSCPL 8、AcSCPL 15、AcSCPL 16、AcSCPL 17 在七叶树种子中表达量最高，其中AcSCPL7，AcSCPL8，AcSCPL16在花中的表 达量仅次于种子，AcSCPL1在花中表达量最高，其次是种子，AcSCPL9、AcSCPL11 与前面表达模式不同，它们在叶片中的表达量最高，其次是种子。这些基因的 表达模式与七叶皂苷组织积累情况基本一致，同时也验证了这些酰基转移酶相 关基因在花和种子中高效表达，为筛选基因提供实验依据。 本论文分别利用原核和真核两个系统对候选酰基转移酶基因进行蛋白表达 探索。通过构建体外蛋白表达载体，诱导蛋白表达，纯化体外重组蛋白，最终 获得体外重组蛋白 （AcBAHD 4，AcBAHD 26），以及酵母微粒体 （AcSCPL 1、 AcSCPL 8、AcSCPL 9、AcSCPL 11、AcSCPL 15、AcSCPL 16、AcSCPL 17）。 关键词：七叶树；七叶皂苷；酰基转移酶；蛋白纯化 II 七叶树七叶皂苷合成途径中相关酰基转移酶候选基因的初步研究 Preliminary Study onCandidateGenesofRelated AcyltransferasesintheAescin SynthesisPathway of Aesculus chinensis Bge Abstract：Aesculus chinensis Bge,alsoknown asBimbisaratree,isadeciduous tree of hept