园艺学实验技术思考题及答案.docVIP

1、请阐明PCR的原理和引物设计的注意事项 原理：PCR技术的基本原理 类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍 注意事项：①引物长度：15-30bp，常用20bp左右；②引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增至10kb的片段；③引物碱基：G+C含量为40-60%为宜，ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸成串排列；④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3’端互补；⑤引物3端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基应严格要求配对；⑥引物中最好有合适的酶切位点；⑦引物应与核酸序列数据库的其他序列无明显同源性；⑧序列Tm为55-60℃ 2、试述Southern技术的原理，操作和注意事项 原理：将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。 操作：①基因组酶切；②用琼脂糖凝胶电泳队DNA片段按分子量大小分离；③将DNA片段在琼脂糖凝胶电泳变性成单链后，再转移到适当的故乡支持物上并与之结合（即转膜）；④探针与膜上DNA杂交；⑤检测 注意事项：①将凝胶中和至中性时，要测定pH，防止凝胶的碱性破坏硝酸纤维膜；②要注意赶走凝胶和滤纸及硝酸纤维膜之间的气泡 3、试述Northern技术的原理操作和注意事项 原理：在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。 操作：①RNA的提取；②RNA变性电泳；③RNA转移和固定（即转膜）；④探针与膜上的RNA杂交；⑤检测 注意事项：①用于RNA电泳、转膜的所有器材均须预处理以除去RNAse，以免样品的降解；②转膜时，注意赶走气泡 4、试述质粒提取的原理和注意事项 原理：碱裂解法提取质粒利用的是共价闭合环状质粒DNA与线状的染色体DNA片段在拓扑学上的差异来分离它们。 在pH值介于12.0-12.5这个狭窄的范围内，线状的DNA双螺旋结构解开变性，在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键虽然断裂，但两条互补链彼此依然相互盘绕而紧密地结合在一起。当加入pH4.8的醋酸钾高盐缓冲液使pH降低后，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链迅速而准确地复性，而线状的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，不能迅速而准确地复性，它们缠绕形成网状结构。 通过离心，线状的染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来，而闭合环状质粒DNA却留在上清液中。 注意事项：（碱裂解法）①加入溶液2后不要剧烈振荡，只需轻轻颠倒几次离心管；②加入溶液2后，复性时间不宜过长，一般是5分钟，否则会使染色体复性；③在用苯酚、氯仿抽提时应用TE缓冲液将原溶液的体积扩大，一般是200～ 300 微升，以减少DNA的损失；④在加入酚氯仿的步骤中，最好用未高温灭菌的离心管，因为高温过程中可能使管口变形，使得振荡混匀过程中酚氯仿容易溢出；⑤溶液2不可冷冻,现用现配；⑥提取过程应尽量在低温环境进行；⑦反应中加入的研浓度要控制好 5、试述载体构建的流程和注意事项 流程：①克隆目的基因片段：设计引物，进行目的基因片段的pcr，连T载体，转化大肠杆菌，提质粒，通过pcr或酶切鉴定；②酶切：用相同的酶酶切插入目的片段的T载体及表达载体，回收目的片段与表达载体的大片段；③连接：连接回收的目的片段与表达载体的大片段