实验4和5 苜蓿愈伤组织诱导.pdfVIP

实验四、 实验四、 实实验验四四、、苜蓿无菌苗的培养 实验五 实验五 实实验验五五、苜蓿愈伤组织诱导 【目的要求】：1、学会种子的消毒方法； 2、学习接种操作技术规范。 【实验内容】：1、种子的挑选； 2、种子的消毒； 3、接种技术； 4、离体培养； 5、学会辨别下胚轴的方法并了解组织培养外植体的选择； 6、利用离体培养技术建立了多种植物的无性繁殖体系。 【实验用具】：超净工作台、酒精灯、平皿、三角瓶、枪形镊、标签纸、记号笔、pH试纸等。 【实验药品】：各种盐类以及有机物质按照MS培养基配方准备，0.1%氯化汞，蔗糖，琼脂。 【实验方法】：1、种子的挑选原则：挑选饱满有光泽的成熟种子 2、种子的消毒： (1) 清水冲洗3遍； 以下在无菌工作台进行 (2) 75％酒精浸泡30秒，将酒精倒入废液缸； (3) 0.1％的氯化汞浸泡12分钟，将废液倒入废液缸； (4) 再用无菌水清洗3边，废水倒入废液缸； (5) 将消毒好的种子平分到带滤纸的培养皿中。 3、接种（无菌工作台） (1) 取装有MS培养基的培养瓶，用酒精棉球将瓶外擦拭消毒，同时将 手及台面擦拭消毒； (2) 将种子均匀整齐接入培养瓶，包好封口纸； 4、培养：将接种好的培养瓶送入培养间25±2℃光照培养3－7天。 5、愈伤组织的诱导：将苜蓿幼芽从培养瓶取出放入带有滤纸的培养皿中，用 手术刀截取下胚轴；再将下胚轴截成3－5mm 小段，均匀整齐接入盛有 MS附加激素 2,4-D和6-BA的培养瓶。 6、愈伤组织的培养：将接好的培养瓶送入培养间25±2℃暗培养3周继代。 思考题： 1、愈伤组织诱导污染调查:观察污染情况，填入下表： 观 接 污 污 主 观察日期 接种数 污染数 污染率 主要污染菌种 污染率（%）=（污染的外植体数/总接种外植体数）×100％ 2、外植体用消毒剂消毒后，为什么要用无菌水漂洗？ 3、在接种过程中，通过哪些措施来防止细菌对接种工具，接种材料的污染？ 4、对外植体表面消毒时为什么常用“两次消毒法”？ 5、观察接种的外植体在接种1 周后产生愈伤组织的颜色和质地，计算愈伤组织诱导 率。 愈伤组织诱导率（%）=（形成愈伤组织的材料数/总接种材料数）×100% 6、分析影响愈伤组织诱导和分化的主要原因。