实验一聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段.pptVIP

实验一(1) 聚合酶链式反应 (PCR)扩增DNA片段 Polymerase Chain Reaction 实验目的 实验原理 实验仪器、材料与试剂 实验步骤 实验结果与讨论 注意事项 实验目的 掌握PCR反应的原理及技术 实验原理 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）简称PCR技术，是一种体外扩增特异DNA片段的技术； 利用PCR技术可在短时间内获得数百万个特异的DNA序列的拷贝； PCR技术在分子克隆、遗传病的基因诊断等方面得到了广泛的应用。 PCR技术实际上是在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。 PCR技术的特异性取决于引物和模板DNA结合的特异性。 原理 反应体系： 含有目的基因或序列的DNA模板 一对脱氧寡核苷酸引物（primer） 热稳定的DNA聚合酶（Taq酶） 4种脱氧核苷三磷酸(dNTP) Buffer及Mg 2+等 PCR技术的参数主要有7个： 模板 引物 聚合酶 dNTPs 反应Buffer 二价离子 一价离子 反应过程： 变性：升高温度使模板DNA变性、双链分开； 退火：再降低温度使引物与模板DNA配对互补结合； 延伸：然后升温到聚合酶反应适宜的温度，此时在聚合酶催化下，从引物3’-羟基端开始，与模板DNA上的碱基配对逐个加上核苷酸，合成新的DNA链。 循环：其后再按高温变性、低温退火、适温合成三步反复循环，新合成的DNA在下一循环中又作为模板使用，每循环一次，合成的目的序列扩增一倍 或者说，反应分为三步： 变性：在高温条件下，DNA双链解离形成单链DNA； 退火：当温度突然降低时引物与其互补的模板在局部形成杂交链； 延伸： 在DNA聚合酶、dNTPs和Mg2+存在的条件下，聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应。 以上三步为一个循环，每一循环的产物可以作为下一个循环的模板，几十个循环之后，介于两个引物之间的特异性DNA片段得到了大量复制，数量可达到106-107个拷贝。 镁离子浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性；浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。 循环次数：当其它参数确定之后, 循环次数主要取决于DNA 浓度。一般而言25-30轮循环已经足够；循环次数过多,会使PCR 产物中非特异性产物大量增加。 在扩增后期,由于产物积累,使原来呈指数扩增的反应变成平坦的曲线，产物不再随循环数而明显上升,这称为平台效应。 平台期会使原先由于错配而产生的低浓度非特异性产物继续大量扩增，达到较高水平 M marker 1-2 普通Taq酶 3-4 hotstart Taq酶 三、实验仪器、材料与试剂 （一）仪器 1. PCR仪 2. 台式离心机 3. 微量取液器 4. 紫外荧光观测仪 5. 高压灭菌的微量离心管 6. DNA扩增系统 7. 琼脂糖凝胶电泳系统 （二）材料 模板DNA : 500bp的片段插入在pMD18-T 载体 （三）试剂 2× PCR Mix （Tiangen天根） M13F， M13R pMD18-T Vector ?????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? 四、实验步骤 1. 总体系（20μL）： ddH2O 7.5μl×6 M13F（通用引物） 0.75μl×6 M13R（通用引物） 0.75 μl×6 模板 1μl×6 2 × Mix(含dNTP、Taq酶、Buffer等) 10μl ×6 注：做一管阴性对照，即模板为灭菌的双蒸水 M13F（通用引物）: GAG CGG ATA ACA ATT TCA CAC AGG M13R（通用引物）: CGC CAG GG