荧光定量PCR实验数据剖析.pptVIP

荧光定量PCR实验数据分 析与常见问题解决 技术支持 cologie 内容 Life Technologies公司定量PCR仪产品概览 荧光定量PCR实验数据分析 荧光定量PCR实验常见问题的解决 AB荧光定量PCR仪的发展历史 1995世界上第一台定量PCR仪-7700型诞生 1997推出面向医疗系统用户的5700型定量PCR仪 2000推出7900型384孔定量PCR仪 2001推出7900型96孔定量PCR仪 2001推出7000型96孔定量PCR仪 2004获得定量PCR仪专利一确立AB在业界内的领先地位 2004第5代定量PCR仪7300\7500型诞生 2007第6代定量PCR仪 StepOne和 StepOne Plus问世 2010第7代定量PCR仪ⅥiiA7发布 2011最新荧光定量PCR仪 Quantstudio12 K Flex发布 AB荧光定量PCR仪家族 第 代第三、四代第五代 第六代 770057007000790073007500 stepone/plus 第七代 最新型 ViA 7 QuantStudio 荧光定量PCR实验数据分析 荧光PCR实验结果的分析流程 查验扩增曲线 检查NTc 检查阳性对照 检査阴性对照 检查/调整基线 检査/调整阈值 分析样品数据 基线与阈值线的设置 般情况下选择软件默认的“自动设置”; 特殊情况下或必要时,可以手动设置: 手动设置的原则请查询“ Data Analysis on the ABI PRISMO7 Sequence Detection System: Setting Baselines and Thresholds: Guide:RevA”,文件号:4370923。 Default sett 回 Automatic Threshold C kuto baselin Start Cycle:[3-End Cycle: 15: Settings for RNase P TAMRA- CT Settings to Use: L Use Default Settings 口 Automatic Threshold Threshold: 0.2 口 Automatic Baseline Baseline Start Cycle: 3: End Cycle: 15- 基线的设定 系统背景信号,在扣除背景过程中影响扩増信号的数值,最终影响Ct值 默认自动分析,比如设定在“3-15”个循环 手动设置时要避开前期的荧光波动与后期的扩增信号。 必要时可以独立设定制定样品的基线取值范围(V2.0)。 ication plct LUnn CTSetrmsDhrtndtr Shov□ RA AUTD Aspr scinc 阈值线的设定 默认设定为同类扩增基线信号标准差的10倍,反映扩增信号具 有统计学显著的意义。不同扩增子应当独立设定阈值线 手动设置在“指数扩增期”,避开前期的背景荧光波动与后期 的非指数扩增及阴性对照最高点 对于绝对定量实验,阈值线设定在使得标准曲线的决定系数值 (R2)接近1,斜率接近-3.32的地方。 对于无标准曲线的实验,阈值线设定在使得重复样品Ct值差异 最小的位置 阈值线设定在保障灵敏度均为最佳的位置 Pbt Type ARn vs Cyde. Graph Type: Log Cao Well 戶户画和区≡ 实验结果的考评指标 定性实验: ·是否为显著的“S型”扩增曲线 扩增曲线的“高度”——表示体现扩增性能的“强度” 阳性对照的Ct值是否在“预期”的位置 过早—一污染或加样错误 过晚—一存在抑制剂或扩增体系条件不佳 阴性对照是否报告Ct值 污染、探针特异性差、阈值线设定过低 绝对定量实验 标准曲线的斜率或扩增效率 标准曲线的决定系数值:R2 检测样品是否偏离标准曲线 ·重复样品Ct值的标准差