转录组研究技术方法及当前资料20页.ppt

●转录组的研究技术方法及当前进展 郑忠巧 生物工程一班 什么是转录组? o广义转录组( Transcriptome)系指从一种细胞或者 组织的基因组所转录出来的RNA的总和,包括编码 蛋白质的mRNA和各种非编码RNA(rRNA,tRNA snoRNA, snRNA microrna和其他非编码RNA 等)。狭义转录组系指所有参与翻译蛋白质的 mRNA总和 为什么研究转录组? o转录组是连接基因组遗传信息与生物功能的蛋白质 组的纽带,转录水平的调控是最重要也是目前研究 最广泛的生物体调控方式。转录组的研究比基因组 的研究能给出更高效的有用信息。比如,人类基因 组包含有30亿个碱基对,其中大约只有5万个基因转 录成mRNA分子,而转录后的mRNA仅部分被翻译 生成功能性的蛋白质。与基因组不同,转录组更有 时间空间性。比如,我们人体大部分细胞具有一模 样的基因,而即使同一细胞在不同的生长时期及 生长环境下,其基因表达情况也是不完全相同的 所以,除了异常的mRNA降解现象(如转录衰减) 以外,转录组反映的是特定条件下活跃表达的基 因 研究转录组的基本方法 o目前研究转录组的方法主要有:(1)基于杂交技术 如cDNA芯片和寡聚核苷酸芯片;(2)基于测序技 术,如早先给予 Sanger测序的SAGE( Serial Analysis of Gene Expression) FIMPSS(Massively Parallel Signature Sequencing),全长CDNA文库和 EST文库的测序分析现在对CDNA、EST等的测序工 作已升级为代测序技术,第一代测序技术较 Sanger 测序技术通量更高,运行时间更短,测序片段更长 (3)基于新一代高通量测序技术的转录组测序,现 在通常将基于第二代测序技术的转录组测序分析称 为 RNA-Seq 转录组的各个研究方法的特点 o(1)基于杂交技术的特点 o基于杂交技术的DNA芯片技术只适用于检测已知序 列,却无法捕获新的mRNA。细胞中mRNA的表达 丰度不尽相同,通常细胞中约有不到100种的高丰度 mRNA,其总量占总mRNA一半左右,另一半 mRNA由种类繁多的低丰度mRNA组成。因此由于 杂交技术灵敏度有限,对于低丰度的mRNA,微阵 列技术难以检测,也无法捕获到目的基因mRNA表 达水平的微小变化 2)SAGE法的特点 SAGE是以 Sanger测序为基础用来分析基因群体表达 状态的一项技术。SAGE技术首先是提取实验样品中 RNA并反转录成CDNA,随后用锚定酶 ( Anchoring enzyme)切割双链CDNA,接着将切割 的CDNA片段与不同的接头连接,通过标签酶酶切 处理并获得得到SAGE标签,然后PCR扩增连接 SAGE标签形成的标签二聚体,最后通过锚定酶切除 接头序列,以形成标签二聚体的多聚体并对其测序 SAGE可以在组织和细胞中定量分析相关基因表达水 平。在差异表达谱的研究中,SAGE可以获得完整的 转录组学图谱以及发现新的基因并鉴定其功能、作 用机制和通路等。 (3)MPSS法的特点 o MPSS是SAGE的改进版,MPSS技术首先是提取实 验样品RNA并反转录为cDNA,接着将获得的cDNA 克隆至具有各种 adaptor的载体库中,并PCR扩增 克隆至载体库中的不同cDNA片段,然后在 T4DNA聚合酶和dGTP的作用下将PCR产物转换为 单链文库,最后通过杂交将其结合在带有Ant adaptor的微载体上进行测序。MPSS技术对于功 能基因组硏究非常有效,能在短时间内捕获细胞或 组织内全部基因的表达特征。MPSS技术对于鉴定致 病基因并揭示该基因在疾病中的作用机制等发挥了 重要作用 (4)高通量测序技术的特点 SAGE及MPSS技术的低通量模式切换至RNA-seq的高 通量模式。作为蛋白质组研究的基础,RNA-seq可以 识别比蛋白组高一两个数量级的基因,从而帮助科学 家构建完整的基因表达谱以及蛋白质相互作用网络。 RNA-seq对于真核生物的基因表达调控,癌症等疾病 的发生机制和新治疗方案确定,遗传育种等方面的研 究具有不可估量的潜力 RNA-seq的特点及应用 二代测序在转录组的研究上越来越普遍,大有替代先 前的基因芯片( microarrays)和基因表达系列分析技 术势 ( serial analysis of gene expression,SAGE)之趋 。由于测序深度的优势,RNA-seq更能全面地揭 示生物个体在特定时刻和特定组织的全局基因表达 情况,如发现新的转录本、了解基因表达量、挖掘单 核苷酸的多态( single-nucleotide polymorphisms SNPs)、选择性剪接( (a