低共熔溶剂辅助糖苷酶转化黄酮苷的研究.pdfVIP

中文摘要 摘 要 黄酮类化合物是一类具有抗炎、抗癌、抗高血压、抗糖尿病等多种药理活性 的化合物，大部分以糖苷形式存在于植物体内，仅有小部分以游离苷元形式存在。 相比于黄酮糖苷类成分，黄酮苷元的脂溶性更好，更易被人体吸收，生物利用度 更高。研究表明，绝大多数黄酮类化合物的药理活性主要来源于黄酮苷元。因此， 为了得到更多的活性苷元，充分利用黄酮类化合物的药理活性，人们开展了黄酮 糖苷类化合物转化为黄酮苷元的研究工作。其中，采用化学转化法和酶转化法对 黄酮糖苷类化合物进行结构修饰是研究的热点之一。相比于化学方法，酶转化方 法具有专一性强、催化效率高、反应条件温和、无水解副产物产生等优点。在实 际生产应用中，酶转化方法受到多种因素的影响，其中，酶促反应溶剂是最重要 的因素之一。溶剂不仅可以影响酶促反应速率，溶剂本身的理化性质如极性和pH 等还能显著影响酶的活性和稳定性。目前，大多数酶促反应都是在缓冲液或有机 溶剂中进行，然而，这些传统的溶剂都不是酶发挥催化活性的最适反应溶剂，有 机溶剂甚至会抑制大多数酶的活性。因此，寻找一种合适的酶促反应溶剂是酶转 化方法应用于实际生产中亟待解决的问题。低共熔溶剂 (DESs) 是一类由氢键供 体和氢键受体通过氢键作用形成低熔点的共熔物，有良好的生物相容性和广泛的 溶解性能，可以提高酶的催化活性和稳定性，在生物催化领域应用前景广阔。因 此，本文利用DESs 作为新型的酶促反应溶剂，解决酶转化中的酶活性低、底物溶 解性差等关键问题，从而应用于黄酮糖苷类化合物的高效转化，期望获得更多的 活性黄酮苷元类成分。 本研究首先以糖苷酶为对象，研究了酶在DESs 中的催化活性和稳定性及其作 用机制。随后，利用DESs 独特的溶剂性质，开展DESs 应用于糖苷酶转化黄酮苷 的研究。本文的研究内容主要包括以下三个方面： ① 以氢键供体和受体通过氢键作用形成低熔点的共熔物为理论依据，采用加 13 1 热法合成了9 种不同类型的DESs 。采用 C-NMR 、H-NMR 、FT-IR 、DSC 检测 方法分析了新型溶剂的形成机制和理化特性，同时探讨了氢键供体和受体两组分 之间的相互作用，进一步解释了共熔物的低熔点现象。 ② 以DESs 为酶促反应溶剂，以β-葡萄糖苷酶为对象，探究了酶在非水介质 DESs 和水介质DESs (DESs-缓冲液体系) 中的催化行为。结果表明，DESs 能显著 提高β-葡萄糖苷酶的催化活性和稳定性。不同类型DESs 对酶催化反应的影响不同， 这主要由组成溶剂的氢键供体决定。同时，考察了含水量对DESs 与酶蛋白分子相 互作用的影响。一定量的水可以降低DESs 的黏度，还可以维持酶在DESs 中的分 I 重庆大学硕士学位论文 子柔性结构。最后，采用酶动力学分析β-葡萄糖苷酶在不同溶剂体系的催化反应， 比较了酶动力学参数米氏常数K 、转化数K 和最大反应速度V ，初步探究了 m cat max 酶促反应的作用机制。 ③ 以DESs 为反应溶剂，以β-葡萄糖苷酶为催化剂，同时首次采用微波辅助 技术将黄酮糖苷高效地转化为活性苷元成分。通过响应曲面法优化了酶解黄酮苷 的条件，获得最佳的工艺条件为：氯化胆碱:乳酸溶剂 (ChCl:LA) (46%, v/v) 、pH 4.8 、 5 mg/mL β-葡萄糖苷酶、2.2 mM 黄酮苷、微波加热 (70 W、72°C) 反应20 min ， 此条件下黄芩苷的转化率可达96.63% 。 本研究以DESs 为酶促反应溶剂，提高了β-葡萄糖苷酶的活性和黄酮类化合物 的溶解性，并且首次采用微波技术，以DESs 为溶剂，利用β-葡萄糖苷酶转化黄酮 苷，实现了黄酮类化合物中 90%-97%的糖苷成分转化为活性苷元。因此，本研究 基于绿色化学理论，为深入研究非水相酶催化提供了一定的指导，同