异源表达NADH选择性氧化酶提高光滑球拟酵母酵解速率及丙酮酸生产强度.docx

研究报告Re s e arc h Pap 研究报告 Re s e arc h Pap er 微生物学报 Acta Microbiologica Sinica 49 (11) :1483 - 1488 ; 4 November 2009 ISSN 0001 - 6209 ; CN 11 - 1995ΠQ http :ΠΠjournals. im. ac . cnΠactamicrocn 异源表达 NAD H 选择性氧化酶提高光滑球拟酵母酵解速率及 丙酮酸生产强度 秦义 ,董志姚 ,周景文 ,刘立明 3 ,陈坚 3 (江南大学 ,食品科学与技术国家重点实验室 ,无锡 214122) 摘要【: 目的】进一步提高光滑球拟酵母 ( Torulopsis glabrata) 葡萄糖代谢速率及丙酮酸生产强度 。【方法】将源 于荚膜胞浆菌 ( Histoplasma capsulatum ) 的编码选择性氧化酶的 AOX1 基因过量表达于 T. glabrata 中 ,获得了 一株线粒体内 NADH 氧化途径发生改变且胞内总 NADH 氧化酶活性提高 118 倍的重组菌株 AOX。【结果】与 出发菌株 CON 比较 ,细胞浓度以及发酵周期降低了 2013 %和 1017 % ,而平均比葡萄糖消耗速率和丙酮酸合 成速率分别提高了 3417 %和 5411 % 。其原因在于 NADH 选择性氧化酶过量表达 ,导致胞内 NADHΠNAD + 比 率和 ATP 含量分别降低了 7417 %和 5219 % , 而磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶活性分别提高了 18510 %和 2811 % 。【结论】构建线粒体内非产能的 NADH 氧化途径 ,加速 NADH 氧化的同时降低 ATP 合成 ,能有效地提 高酵母细胞糖酵解代谢速度及目标代谢产物的生产强度 。 关键词 : 光滑球拟酵母 ; NADH 选择性氧化酶 ; NADH ; 糖酵解速率 中图分类号 :Q935 文献标识码 :A 文章编号 :000126209 (2009) 1121483206 脱氢酶氧化成 NAD + 2 - 3 ;而线粒体内的 NADH 主要 通过电子传递链氧化成 NAD + , 相应地生成大量 ATP 。前期研究表明 , 光滑球拟酵母中高浓度的 ATP 抑制糖酵解关键酶磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶 活性 ,在一定范围内降低胞内 ATP 含量能有效地提 高糖酵解速度 。而改变胞内 NADH 氧化途径是降低 胞内 ATP 水平的同时提供足量 NAD + 的一种有效 策略 。 本研究将荚膜胞浆菌 ( Histoplasma capsulatum ) 中编码 NADH 选择性氧化酶的 AOX1 基因4 表达于 T1 glabrata 中 ,构建一条异源 NADH 氧化途径 。该 异源 NADH 氧化途径能有效地将源于 NADH 的电子 流从细胞色素途径中的泛醌处分流 ,绕过复合物 Ⅲ 提高糖酵解速度是所有以糖质原料为底物的工 业发酵过程共同关心的问题 ,但糖酵解速率受其关 键酶活性 、细胞内 NADH 氧化途径及效率和 ATP 浓 度等 条 件 所 控 制 , 其 中 最 为 重 要 的 影 响 因 素 是 NADH 氧化途径及其效率 。因为 NADH 氧化途径及 效率不仅影响糖酵解途径关键酶的反馈抑制物质 ATP 水平 ,同时影响糖酵解的底物 NAD + 水平 ,这两 者的丰度最终影响糖酵解的关键酶活性 。微生物细 胞内 NADH 主要来源于糖酵解途径 、三羧酸循环以 及脂类代谢 。由于 NADHΠNAD + 不能穿过线粒体 膜1 ,导致细胞质与线粒体中具有不同的途径将 NADH 氧化为 NAD + 。在胞质中 , NADH 主要通过 NADH 脱氢酶 、乙醇脱氢酶 、3 - 磷酸甘油脱氢酶等 基金项目 :国家杰出青年基金 ; 国家自然科学基金 ; 国家“973 项目”(2007CB7l4303) ;全国优秀博士学位论文作者专 项资金(200962) 3 通信作者。Tel : + 862510285918307 ; E2mail : mingll @jiangnan. edu. cn ; jchen @jiangnan. edu. cn 作者简介 :秦义(1982 - ) ,男 ,安徽亳州人 ,博士研究生 ,主要从事分子及微生物代谢方面的研究。E2mail : @sian. com 收稿日期 :2009206205 ;修回日期 :2009208207 Yi Qin et al . ΠActa Microbiologi Yi Qin et al . ΠActa Microbiolog