组织切片技术.pdfVIP

组织切片技术注意事项 程序步骤 1、取材 2、固定 （固定24h— 1W） 3、包埋 石蜡切片： 流水冲洗组织块 75%酒精 1h85%酒精 1h95%酒精 1h100%酒 精（ 1）1h100酒精（ 2 ）1h二甲苯 8-20min石蜡 2h包埋 冰冻切片：固定后的组织 OCT包埋 切片或 -20 度保存； 液氮中的组织 转入 -20 度OCT包埋 切片或保存 4 、切片 切片 展片（ 40~50 度） 贴片干燥（ 37 度过夜或者 50~60 度 2h ） 5、HE染色 干 燥 后 的 切 片 二 甲苯 （1 ） 10min二 甲 苯 （2 ） 10min100%酒 精 (1)1min100%酒精(2)1min95%酒精 1min85%酒精 1min75%酒精 1min 蒸馏水 3min苏木精染色 30s—5min 自来水涮洗 蒸馏水 75%酒精 1min85%酒精 1min伊红染色 85%酒精涮洗 95%酒精 1min100%酒精 (1)1min100%酒精（ 2）1min二甲苯（ 1）10min二甲苯（ 2 ）10min中 性树胶封片 6、免疫组化（ ABC法） （1）干燥后的石蜡或冰冻切片（冰冻切片需要缓慢复温）脱蜡至水； （2）双氧水（ 1%浓度左右）封闭内源性过氧化物酶； （3）PBS洗涤 3×5min； （4） 5%BSA封闭非特异性结合位点，不洗； （5）滴加适当稀释度的一抗； 4 度孵育过夜或 37 度 2h ； （6）同上洗涤；滴加二抗， 37 度 1h； （7）同上洗涤；滴加 ABC复合物， 37 度 1h； （8）洗涤 5 遍，每次 5min； （9）配制显色液（ DAB显色试剂盒），显微镜下观察显色； （10）切片浸泡于蒸馏水中终止显色； （11）苏木精复染，脱水，封片。 注意事项 取材 1. 组织越新鲜越好，最好于动物处死后 10~20min完成取材，时间过久后组织 自溶和腐败会影响组织形态。 2. 取材组织块不宜过大，一般为 5nm以下，2~3nm为宜。如果试验要求采取大 块组织，最好采样前注射固定液预固定或采取灌流固定（比如取脑时需灌流固 定）。 3. 取材使动作轻柔，避免用力夹、捏和拉扯组织，尽可能保持组织原有形态。 操作时可用镊子夹取组织的一个边角，避免主要组织损伤。 4. 如果是大批量取材，取材时没有时间对组织块大小进行修正，可将组织（可 稍大，但不宜过大）先放在固定液中固定， 2~4h 后进行修块，即用锋利的刀片 （刮胡刀片）把组织切至适宜大小。注意不能用剪刀等进行钝性分离。 5. 如果对不同处理或不同动物的组织进行比较研究，应对所有动物在同一解剖 学位置取材（比如十二指肠距胃 3cm处，或空肠距胃 10cm处）。 6. 取材时注意组织的不同断面，可将组织的一面用刀片切平作为标示，以便包 埋和切片时选取的断面正确（比如肌肉组织，应区分好横断面和纵断面）。 7. 一般情况下宰杀动物应放血干净，取材时除去组织周围的附属物，比如筋 膜、脂肪等。 8. 取得的组织立即固定。冰冻切片组织可先固定后冻存，也可直接冻存，直接 冻存一般采取液氮中速冻，然后转入 -20 度保存，冻存组织应避免反复冻融， 且尽快进行切片或用 OCT包埋（包埋后可放置较长时间）。未包埋的组织在 -20 度长期保存的组织会逐渐脱水（比如肌肉），影响形态学观察。 9. 理论上免疫组化的组织采取冰冻切片，一般运用 4%多聚甲醛固定 24~48h 后 用 OCT包埋冻存。但对于