新型视网膜病变模型的建立及其病理机制的研究.pdfVIP

中文摘要 摘 要 背景 糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy, DR ）是糖尿病人最常见的并发症之一， 也是工作年龄阶段（20 至65 岁）人群致盲的主要病因，且病变通常是不可逆的。 DR 是一类由于视网膜长期功能和结构损伤引起的渐行性疾病，其病理过程涉及视 网膜细胞生化与代谢异常的复杂相互作用，主要的病理机制包括细胞凋亡、氧化 应激、炎性反应和血管基底膜的改变。临床上DR 可分为早期非增殖型与晚期增殖 型。早期非增殖型组织病变的主要表现是：视网膜血管选择性的周细胞缺失 （pericyte loss, PL ），无细胞毛细血管（accellur capillary, AC ）的生成，基底膜 （basement membrane, BM ）增厚，血管密度的降低，内核层与外网层出血，以及 外网层嗜酸性渗出物的增加。晚期增殖型病变的主要特征是：视网膜血管新生和 玻璃体出血。目前DR 主要治疗策略仍是通过药物手段抑制血管新生，但由于视网 膜已经发生不可逆性病变导致疗效不理想，因此迫切需要对DR 进行早期的诊断与 干预。 肌浆网内质网钙ATP 酶（sarcoplasmic/endoplasmic reticulum calcium ATPase, SERCA）能利用ATP 水解提供的自由能将细胞质Ca2+主动转运至肌浆网与内质网 中，是一类维持细胞内的Ca2+稳态的膜转运蛋白。SERCA 普遍存在于真核细胞肌 浆网和内质网中，通过维持较低的胞质内 Ca2+浓度保证多种生理调节与信号转导 的正常运行。细胞内较高浓度的 Ca2+可以通过激活下游通路引起血管细胞的凋亡 以及内皮钙粘蛋白（vascular endothelial-cadherin, VE-cad ）/连环蛋白复合物紧密连 接的重排，进而破坏内皮细胞的屏障功能，导致血管通透性的改变与血管新生。 SERCA2 是血管中SERCA 的主要亚型，主要包括SERCA2a 和SERCA2b 两 种基因型，其674 位半胱氨酸（cysteine 674, C674 ）是一关键的氧化还原位点。C674 中巯基（C674-SH）的谷胱甘肽化能够增加SERCA2 的活性，从而通过调控Ca2+ 参与细胞的生理活动。在糖尿病、动脉粥样硬化等血管疾病的动物模型以及患者 主动脉中均发现SERCA2 中C674-SH 发生了显著的不可逆性氧化（C674-SO H ）， 3 干扰了该位点的谷胱甘肽化调控。目前有关SERCA2 及其C674 位点在微血管系统 的生理病理调控机制仍然不甚明确。我们推测在病理条件下SERCA2 中C674 的不 可逆氧化引起的C674 谷胱甘肽化位点的失活参与了视网膜病变的形成。 为了明确SERCA2 中C674 这一氧化还原位点的失活是否直接导致视网膜病变， 我们利用C57BL/6J 背景下构建的SERCA2 中C674S 基因敲入（SERCA2 C674S knock-in ）小鼠，也就是在 674 位点用丝氨酸 （serine, S ）取代了半胱氨酸 I 重庆大学硕士学位论文 （C674→S674），来模拟病理情况下C674 的不可逆氧化导致的这一氧化还原位点 的失活。由于纯合子胎儿在血管发育初期（8-10 d）就于子宫内死亡，因此所有实 验都是在杂合子SKI（C674/S674 ）小鼠和同窝的对照野生（wild type,WT, C674/C674 ） 小鼠上进行的。 方法 ①检测I 型糖尿病小鼠视网膜血管中SERCA2 的C674 不可逆氧化程度。 ②检测视网膜中SERCA2 各亚型的丰度及各亚型在WT 小鼠与SKI 小鼠的表 达差异。 ③检测 SKI 小鼠视网膜血管中AC 与PL 的生成、组织结构和血管密度等变 化情况。 ④检测SKI 小鼠与视网膜基底膜改变、细胞凋亡、内质网应激、氧化应激等 相关蛋白的表达情况。 ⑤检测人脐静脉内皮细胞（human umbili