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^LZ-RV ^LZ-RV 【医药】PI染色检测细胞周期 PROTOCOL共3页） PI染色检测细胞周期protocol 1、 离心收集细胞，弃上清，用预冷 PBS洗细胞两次。 2、 加入预冷70聽醇，于4?固定过夜，或-20?长期固定（4?过夜一般隔天就进 行检测，如果想推迟几天测，那就保存在-20?，有资料说-20?可以保存一个月，个 人建议尽量在最短时间内检测，有些实验是在不同时间点上收细胞，这时我就等最 后一次固定完了一块测，基本上也多在一周内检测完毕，没有特地去比较保存时间 对检测结果的影响）。 3、 细胞染色 离心收集细胞，以1mL的PBS洗细胞一次，加入 500uLPBS含50ug/mL溴化乙 锭（PI），100ug/mL RNase A, 0.2% Triton X-100）4? 避光孵育 30 分钟（PI 我是直 接用PBS配成工作浓度，然后加入细胞沉淀混匀， RNA酶现加，但有时不加发现对 实验结果也没太大的影响）。 4、 流式分析 以标准程序用流式细胞仪检测，一般计数 2-3万个细胞，结果用细胞周期拟和 软件ModFit分析。 分析时，使用FL2-W和FL2-A显示，去除联体细胞，具体如下图。 细胞周期流式后一般分为 G0/G1,S,G2/M期三部份，如果有凋亡，在 G0/G1期 前面有个凋亡峰（也称sub-G0期）,而如果分析时细胞窗口没设置好，可能在最前面 t t it T■ 厂丁 t t it T ■ 厂丁「▼ - 11t nr 社和*畀申L甘-占L SOftFlf ■ P2 ■ [■? 02 ?T fwrs ”T：i畀 a?4 EFJfi?财 J IS 皿了 TVi「，1 rv,- f “吓 OiDld 1 0￡ CK? T DI?G M Z9X*r JS 7C DI ?谅：13.0? *41 9! 4S 钏.岂：5 5 it *L.ls PIWH：芒.殆戈 伽? |i*D 0 I? W 吋 fl. 413 S t J”-3 1心 % lFT“rnW If, a i ev^*^er-- i m耳i 〔严 |c T h Ki C F± nN I ￡ - 3 KS l.*O 结果解读 G0/G1期细胞占总的61.2%,峰位于横座标的45.76 G2/M期占13.07，峰位于横座标的91.43 S期占25.73 G2/G1为2.0（即G2期为4倍体细胞，而G1期为2倍体细胞，比值为2） 峰的变异系数为4.54%（好） 细胞碎片为0.48%,细胞聚集体有0.06%。 总的细胞数（仪器检测到的）为17525个， 在细胞周期中分析的细胞数为17431个（即排除了碎片及聚集体后） CV是变异系数。一般CVK小，峰形越好，越尖锐。能控制在 5流右是比较好 的结果， 一般小于10%t可以认可了。 Flow Cytometric Analysis of Cell Cycle Fixation 61) Collect 2 x 10 cells. 2) Pellet cells by spinning at 1,000 rpm, 4?C for 5 minutes. 3) Resuspend cell pellet in 1 ml of cold PBS. 4) Fix cells by adding 4 ml of -20?C absolute ethanol. 5) Store cells at -20?C in this fixation buffer until ready for analysis. (No more than 2 weeks) Staining Centrifuge (as above) fixed cells and resuspend pellet in 1 ml of PBS. Add 100 卩 l of 200 卩 g/ml DNas-eree, RNaseA and incubate at 37?C f or 30 minutes. Add 100 卩 l of 1 mg/ml propidium iodide (light sensitive) and incubate at room temperature for 5-10 minutes. Place samples in 12 X 75 Falcon tubes and read on Becton Dickinson FACStarPLUS. PI 染液配制(100ml):PI 5mg、RNase 2mg 1.0%Triton X-100 0.25ml 、生理盐 水 65ml、 枸橼酸纳100mg加蒸馏水至100ml，调pH值7.2-7.6，用棕色瓶子分装，4? 避光保存。 注意事项 :1 在细胞固定时一定要将细胞吹开