16S、18S等扩增子测序.doc

16S、18S、ITS等扩增子测序 技术说明： 扩增子测序是对特定长度的PCR产物或者捕获的片段进行测序。 16S rDNA测序 :?16S rDNA为编码原核生物核糖体小亚基rRNA的DNA序列，主要进行细菌或古菌的多样性分析。 18S rDNA测序 :?18S rDNA为编码真核生物核糖体小亚基rRNA的DNA序列，反映样品中真核生物之间的种类差异。 ITS 测序 :?该类测序主要对环境微生物中的真菌多样性进行分析。包含两个区域：ITS1位于真核生物核糖体rDNA序列18S和5.8S之间；ITS2位于真核生物核糖体rDNA序列5.8S和28S之间。? 技术路线： 扩增子原始序 扩增子原始序列 优化序列 PCA pCoA NMDS 样品聚类 物种分类数 各层级物种分类聚图 RDA/CCA分析 Metastasts分析 保释性曲线 各样品多样性指数 物种丰度曲线 Alpha多样性分析 Bata多样性分析 物种注释和统计分析 样本要求： 基因组DNA: m≥200ng, c≥6ng/μL PCR产物: m≥1 μg, c≥10 ng/μL ????????? ????????? 服务周期： 标准流程的服务周期约为 30-55 个工作日。 案例解析: 案例一 Defining the core Arabidopsis thaliana root microbiome. [ Nature,2012] 1.背景介绍 ? ? ? ?植物根部微生物生存部位可分为根内、根周边和土壤。其中，根内和根周边微生物对植物生长、生产、碳源固定和植物修复等有重要作用。植物根部虽然有免疫系统，依然允许一些互惠共生微生物的生存。植物对根部微生物的生存的调控机制，现在还不是很清楚。通过16S对微生物种类和数量的分析，来验证根内和根周边微生物的类型，主要取决于植物本身与其基因型，与土壤类型和植物生长阶段无关。首先，文章验证了，根内、根周边和土壤这三个位子的菌群结构有很大差异。根内部菌群结构相对简单，主要以放线菌和变形菌为主。一些菌的数量，还是取决于植物生长阶段的。 2.实验结果 图1. （a）加权重的Unifrac PCoA分析。PCoA1维度能将根内样品与根周边和土壤样品很好的分开；而PCoA2能够将不同土壤的样品 很好的区分开来。（b）用pairwise Bray-Curtis 相似度对样品进行聚类。 图2.（A）样品-OTU热图。纵坐标为可以用来区分根内、根周边和土壤样品的OTUs。?（B）用GLMM方法预测的OTU丰度结果（a）上部红色的bar为预测结果在根内富集的，下部蓝色的为预测在根内稀少的。（b）上部棕色bar为在土壤Mason?Farm的根内部较多的预测结果，下部金色bar为在土壤Clayton的根内部较多的结果。（c）（d）与（a）（b），它们是对跟周边丰度的预测。（C）、(D)、(E)和（F）为不同水平物种结构的分析，从而找出差异。 案例二. Human?Skin?Fungal?Diversity.?[Nature.?2013] 1.背景介绍 ? ? ? ?传统基于培养的方法不能很好的找到运动员脚和脚趾甲的感染起因。人体皮肤正常能够阻止病原微生物的入侵，让一些有益的共生微生物生存。细菌基因组测序研究，一些病因为细菌结构的紊乱。然而，微生物中还有真菌的存在，真菌也在微生物稳态中起到重要作用。但是，相对于细菌而言，真菌研究的方法相对不成熟。真菌分类研究，主要靠一些保守序列，例如核糖体RNA。文中显示，采用ITS方法能够更准确的区分真菌。结合16S，研究了细菌真菌与一些皮肤病的相关性。 2.实验结果 图1.?从左边属水平部分可以看出，真菌属Ascomycetes和Basidiomycetes是两类常见的真菌。其中，?Malassezia属主导地位（对应左边大多数紫色）。右边是对Malassezia属进一步在种水平的组成分析，中水平的组成具有身体部位的特异性。 图2.?（a）PCoA分析得出，真菌中的群体结构差异，主要取决于采样的身体部位。（b）细菌中的群体结构差异，主要取决于物理量（干、湿、油） 参考文献 [1]?Lundberg?D?S,?et?al.?Defining?the?core?Arabidopsis?thaliana?root?microbiome. [Nature,?2012] [2]?Findley?K.,et?al.?Human?Skin?Fungal?Diversity. [Nature, 2013]