（优质医学）病毒的纯化与保存.pptVIP

Western Blot 蛋白质鉴定 原理(重点掌握)：将SDS上的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，让第一抗体与膜上的目的蛋白质的抗原决定簇结合，然后用经过特定酶标记的第二抗体结合第一抗体，加入酶的显色底物即可检测的目的蛋白条带存在与否。 * Western Blot 步骤(熟悉) 1、SDS电泳结束后，不染色，进行转膜，把SDS凝胶上的蛋白转移到NC膜或PVDF膜上。(注意凝胶和膜的放置方向) * Western Blot 步骤 2、膜的染色 (丽春红、氨基黑) 判断凝胶上的蛋白是否已经转移到膜上； 记录蛋白分子量标准/样品的位置； * Western Blot 步骤 3、磷酸缓冲液漂洗，进行膜的脱色 4、膜的封闭 封闭是用高浓度的无关蛋白质封闭膜上未被占据的表面，使抗体仅仅只能跟特异的蛋白质结合而不是和膜结合。常用的封闭液有牛血清白蛋白BSA，脱脂奶粉等，一般用脱脂奶粉。 将膜浸没于封闭液中缓慢摇荡一小时。 * Western Blot 步骤 5、结合一抗 (与目的蛋白结合) 将膜转移到含一抗的封闭液中，室温下轻摇孵育一小时。缓冲液洗涤三次 6、一抗与二抗结合 二抗是一抗的抗体 如果一抗是通过免疫兔子制备，即选择抗兔的二抗，如羊抗兔、鼠抗兔等。 缓冲液洗涤三次 * Western Blot 步骤 7、显色 (1)生物素-亲合素系统 生物素(biotin)标记二抗，生物素容易与亲和素(avidin)结合,而亲和素事先已进行酶标记，如过氧化物酶，则形成 生物素-亲和素-过氧化物酶复合物 加入底物，即可显色 * * Western Blot 步骤 7、显色 (2) 辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP) HRP经过碘酸钠氧化而标记到二抗， 显色底物：二氨基联苯胺（DAB）、氯萘酚和氨乙基咔唑等。 * 病毒的保存(掌握) 1、低温及超低温保存法 低温(-20~-60℃)、超低温(-70℃以下)冰箱 液氮罐(-150~-196℃) 温度越低，保存时间越长； 常用保护剂：脱脂牛奶、5%蔗糖、血清 用保护剂配制病毒悬液或与病毒悬液混合 * 病毒的保存 2、冷冻干燥保存 原理：微生物悬液冷冻后，在真空中使水分由固体直接升华为气体，在低温、干燥和缺氧环境下，微生物的生长和代谢暂时停止，因此保存期较长，便于运输。 * 病毒的保存 2、冷冻干燥保存 保护剂：脱脂牛奶或血清 保护剂作用原理：在冷冻干燥的脱水过程中稳定病毒结构，防止病毒受冷冻或干燥而造成损伤。 * 2、冷冻干燥保存步骤 (1) 准备安瓿管(高压灭菌后备用) * 2、冷冻干燥保存步骤 (2) 制备保护剂：脱脂牛奶 取市售新鲜、清洁、无抗生素污染的牛奶200 g，在5000 r/min下离心10分钟，除去上层奶皮，如此重复两次。然后分装入两个250 ml锥形瓶中，加棉塞并用牛皮纸包头、扎牢，在110℃下灭菌15分钟，冷却后备用。 * 2、冷冻干燥保存步骤 (3) 制备病毒悬液 (4) 分装、预冻 (5) 真空干燥 抽真空前，样品必须处于冷冻状态 (6) 封管 * 小结 掌握：聚乙二醇(PEG)浓缩法、差速离心法、密度梯度法分离病毒的原理以及特点； SDS的原理以及蛋白相对分子质量测定；Western Blot原理；常见的病毒保存方法。 熟悉：病毒纯化原则、其他病毒分离方法原理、SDS和Western Blot的主要步骤； * 葡聚糖柱层析法 将初步浓