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第十六章 高效液相色谱法(HPLC) 一、 概述 二、流程及主要部件 三、高效液相色谱的固定相和流动相 四、高效液相色谱法的分离类型及选择一、 概述 高效液相色谱法（HPLC）是20世纪60年代末70年代初发展起来的一种新型分离分析技术，目前已成为应用极为广泛的化学分离分析的重要手段。2、高效液相与气相色谱法 ①气相色谱法只限于分析气体和沸点较低的化合物，它们仅占有机物总数的20％。 对于占有机物总数近80％的高沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质，目前主要采用高效液相色谱法进行分离和分析。 ②液相色谱固定相类型多，如离子交换色谱和排阻色谱等，作为分析时选择余地大； ③ 通常在室温下操作。④不破坏样品，适合于制备。但缺乏通用的检测器。在实际应用中，两种色谱互相补充。⑤高效液相色谱法灵敏度相对GC较低，这是它的主要缺点。3. 应用 HPLC适于非挥发性和热不稳定组分的分析，因此，在工业、农业、材料科学，尤其是在生物学和医学等方面应用极为广泛。如氨基酸、蛋白质、核酸、烃、碳水化合物、药品、多糖、高聚物、农药、抗生素、胆固醇、金属有机物等分析，大多是通过HPLC来完成的。 二、流程及主要部件1、高效液相色谱仪 可分为4个主要部分：高压输液系统，进样系统，分离系统和检测系统。此外还配有辅助装置：如梯度淋洗，自动进样及数据处理等。高效液相色谱仪He出口检查脉流消除高压泵入口检查储液瓶抽气分布器过滤2?m到检测器分离柱反压调节过滤器压力计注样阀3-1流程3、主要部件：（1）. 高压输液系统 固定相颗粒极细，流动相阻力很大，必须高压输液系统。它是高效液相色谱仪最重要的部件，一般由储液罐、高压输液泵、过滤器、压力脉动阻力器等组成，其中高压输液泵是核心部件。进样装入样品采样环进色谱柱泵入溶剂出口（2）进样系统 目前最常用的为高压进样阀，六通阀。由于进样量可由样品管控制，因此进样准确，重复性好，如图。../动画/FLASH动画教程之--液相色谱/3-3六通进样阀.swf3-3../动画/FLASH动画教程之--液相色谱/3-3六通进样阀.swf进样装置（3）分离系统—色谱柱 色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包括柱管与固定相两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及聚合材料。金属管用得较多。一般色谱柱长5～30cm，内径为4～5mm(GC:30 m, 0.05 - 0.80 mm)，凝胶色谱柱内径3～12mm，制备柱内径较大，可达25mm 以上。高效分离柱 柱体为直型不锈钢管，发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。（4）检测系统 作用—— 用来连续监测经色谱柱分离后的流出物的组成和含量变化的装置。 在液相色谱中，有两种基本类型的检测器。一类是溶质性检测器，它仅对被分离组分的物理或化学特性有响应，属于这类检测器的有紫外、荧光等。 另一类是总体检测器，它对试样和洗脱液总的物理或化学性质有响应，属于这类检测器的有示差折光，电导检测器等。 现将常用的检测器介绍如下:紫外-可见检测器荧光检测器电化学检测器蒸发光散射检测器质谱检测器 目前最常用的检测器主要有：1、紫外-可见检测器补充章节接色谱柱石英窗UV光电倍增管废液 吸收池为微量吸收池，光程为2-10mm, 体积1~10 ?L。 HPLC分析中，约有80%的物质可以在254 nm或280nm处产生紫外吸收。因此该类检测器应用很广。 选波长时注意：溶剂必须能让所选择的光透过，即所选波长不能小于溶剂的最低使用波长。2）二极管阵列检测器（PDA、PDAD或DAD）　是20世纪80年代出现的一种光学多通道检测器。是近10多年内高效液相色谱技术最重要的进步。主要优点：同时检测透过样品的所有波长紫外光，而不是某一个或几个波长。 1、可得任意波长的色谱图，极为方便 2、可得任意时间的光谱图，相当于与紫外联用 3、色谱峰纯度鉴定、光谱图检索等功能，可提供组分的定性信息木质素(复杂酚类聚合物)单环单萜类化合物3)、荧光检测器 特别是芳香族化合物、被一定强度和波长的紫外光照射后，发射出较激发光波长要长的荧光。? 特点： 有非常高的灵敏度和良好的选择性，只对荧光物质有响应；灵敏度要比UV高2?3个数量级，特别适合于药物和生物化学样品的分析。工作原理(荧光的产生)　物质吸收了特征频率光线后，电子从基态中的最低振动能级跃迁到较高的振动能级。下降到基态时发出比原来吸收的频率低、波长长的一种光，就是荧光。被化合物吸收的光称为激发光，产生的荧光称为发射光。　专用型检测器，灵敏度在目前HPLC检测器中最高,用于能激发荧光的化合物。也可用于检测不发荧光但经化学反应后可发荧光的物质。 如氨基甲酸酯农药:在碱性条件下水解产生甲胺，甲胺与衍生化试剂邻苯二甲醛(OPA)、巯基乙醇反应，生成强荧光物质。 三、高效液相色谱的固定相和流动相 （二）