酸浓度对胶原蛋白含量提取的影响(生化设计)演示教学.docVIP

酸浓度对胶原蛋白含量提取的影响 一、设计实验项目名称 研究酸浓度对胶原蛋白含量提取的影响 二、国内外研究概况和发展趋势 胶原是蛋白质中的一种，英文名“collagen”，由希腊文演化而来。胶原是一种白色、不透明、无支链的纤维蛋白质，它主要存在于动物的皮、骨、软骨、牙齿、肌腱、韧带和血管中，是结缔组织极重要的结构蛋白质，起着支撑器官、保护机体的功能。胶原是哺乳动物体内含量最多的蛋白质，占体内蛋白质总量的25％一3O％，相当于体重的6％[1]。胶原蛋白是构成动物支持组织的结构蛋白质，其提取制品已广泛应用于医药、保健、食品加工、化妆品等众多领域，迄今其制品主要是从一些陆生哺乳动物如牛、猪等的皮肤提取[4]。一般蛋白质的提取方法分为酸法、碱法和酶法[ 2 ]．酸水解法迅速而彻底，但色氨酸全部被破坏，丝氨酸和酪氨酸部分被破坏，且产品得率低；碱水解法迅速且彻底，但含羟基和巯基的氨基酸，全部被破坏且产生消旋作用(结构变异)；酶提取法对胶原蛋白破坏性小，能更好更完全地得到活性蛋白，但水解不够彻底[3]。 三、研究目的 在一定的酶浓度下，胶原蛋白的提率基本是随着酸浓度的提高而提高，主要是因为不同的酶都有最适pH值，胃蛋白酶的最适pH为1．7～2．5，0．5 mol／L浓度的醋酸对应的pH值恰好在此范围之内，蛋白浓度的曲线增长也最快，提取率最高[1]。了解酸浓度对胶原蛋白提取的影响，也就是在实验过程中去探测当酸浓度在哪个范围时对胶原蛋白的提取最有利，即最适酸浓度。 四、研究意义 进一步了解胶原蛋白的性质，在更适合的条件下提取更多的胶原蛋白。由于胶原分子内及分子间存在氢键作用、分子间吸引力和一定的化学键交联，从而使胶原具有很高的机械强度。胶原的这一特点以及它具有其它高分子材料无可比拟的生物相容性和生物降解性，使它作为天然高分子材料，在生物医学领域和智能生物材料制备等方面获得了广泛的应用使胶原蛋白更多地用于生物医学领域和智能生物材料制备[2]。 五、研究方案 1、研究内容：酸浓度对胶原蛋白提取的影响，在不同浓度梯度的酸环境中提取胶原蛋白的含量不同。 2、研究方法：控制变量法，分析法。 3、技术路线及其方案 3.1 实验原理：胃蛋白酶消化肌腱的过程中，酸溶胀速度影响着酶对胶原蛋白的消化，同时酶活性受pH影响，且不同的酶对pH有不同要求，利用这种性质有可能可以直接胶原蛋白含量的提取。 3．2主要仪器:冷冻离心机，冷冻干燥机，高速组织捣碎机，分光光度计，试管，试管夹等。 0材料及试剂:猪肌腱(市售)，胃蛋白酶(1：3 000)，浓度分别为0.05mol/L、0.1 mol/L、0.3 mol/L、0.5 mol/L HAc溶液,10%的NaCl, 0．5 mol／L的HAc(1／20，v／v)，0．02 mol／L的NazHPO4(pH8．8)其他药品均为分析纯。 3．3 实验步骤： 胶原蛋白的提取胶原蛋白容易受热变性，所以本实验均在低于10℃ 的条件进行。 3．3．1 预处理将新鲜猪肌腱洗净，浸人10% 的NaC1溶液中12 h，以除去盐溶性杂质，用去离子水洗涤2—3次，然后加适量水在高速组织捣碎机打浆混匀。 3．3．2 操作如下： 猪肌腱原浆液 （ml） 胃蛋白酶（ml） HAc溶液浓度（mol/L） HAc溶液体积（mL） 1号Ep管 2 0.2 0.05 1 2号Ep管 2 0.2 0.05 1 3号Ep管 2 0.2 0.05 1 4号Ep管 2 0.2 0.1 1 5号Ep管 2 0.2 0.1 1 6号Ep管 2 0.2 0.1 1 7号Ep管 2 0.2 0.3 1 8号Ep管 2 0.2 0.3 1 9号Ep管 2 0.2 0.3 1 10号Ep管 2 0.2 0.5 1 11号Ep管 2 0.2 0.5 1 12号Ep管 2 0.2 0.5 1 充分混匀，经酶处理几小时后，离心(3 000 r／min)分离取上层清液。 3．3．3 盐析在Ep管上层清液中分别加人NaC1进行胶原蛋白盐析，NaC1浓度为2 mol／L，离心分离(8 000 r／min)，沉淀即为胶原蛋白，然后将胶原蛋白重新溶解于0．5 mol／L的HAc，重复盐析两次。 3．3．4 胶原蛋白透析纯化：将胶原蛋白溶解于0．5 mol／L的HAc中，然后在0．02 mol／L的NazHPO4(pH8．8)中透析2—3 d，每8 h换一次透析液，最后得到的是纯度较高的胶原蛋白水溶液。 3.4 胶原蛋白含量的测定：将得到的较高浓度的胶原蛋白溶液，应用凯氏(kiddah1)定氮法（此方法用于蛋白质含量准确的测定，且干扰少）方法进行测定。 4、预期结果：将4