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基因载体 青岛大学药学院 药剂学教研室 韩尚聪 2 基因药物 稳定性 脱靶效应 抑制效率 递送 3 基因药物 circRNA lncRNA Crispr/Cas9 Micro RNA saRNA siRNA Plasmid DNA DNA 4 Biotechnology journal 6, 1130-1146 (2011). 基因药物 负载/组装 + 稳定剂型 给药 5 基因药物的负载 吸附 静电作用 物理吸附 缠结 聚合物 亲疏水作用 脂质体 化学键接 大分子前药 拓扑结构 核酸笼 核酸环 氢键/配位键 苯硼酸 碱基 6 静电吸附 负电荷 基因载体 正电荷 -NH2 -NH-R -NR2 胺类 -NH-CNH-NH2 酰胺？ 7 8 介孔硅 /多孔材料 /空心硅球 物理吸附 9 10 多孔羟基磷灰石 11 氢键/配位键 苯硼酸 拓扑结构 12 高分子链缠结 熵减过程 13 14 亲疏水作用 脂质体： 磷脂、胆固醇、关键脂质（功能脂质） 阳离子脂质体 15 16 硅质体/瓷质体 17 Cationic lipid DLinKC2-DMAis shown in yellow, cholesterol in pink, DSPC in gray, lipid polar moiety in cyan, PEG-lipid in violet, and nucleic acids (duplex DNA) in red; water not shown for clarity. 18 化学键接 19 20 入胞 跨膜转运 膜融合 内吞作用（巨胞饮/网格蛋白/膜窖蛋白/网格蛋白膜窖蛋白非依赖） ATP依赖 电转染 其他 21 跨膜转运 细胞穿透肽（cell penetrating peptides，CPPs） 22 膜融合脂质体 23 膜融合脂质体 24 25 内吞作用（ endocytosis ） 巨胞饮macropinocytosis 0.5~2 μm 形成内吞体尺寸较大，表面能更低，所消耗能量也较低，故巨胞饮是最常见的细胞内吞途径。 内吞小泡最终于溶酶体融合，内部酸化 26 27 网格蛋白介导内吞clathrin-dependent endocytosis 纳米颗粒粘附在细胞膜表面时，在细胞中网格蛋白和衔接蛋白的作用下形成网格蛋白包被的网格蛋白小泡并转运到细胞质中，接着与早期溶酶体融合。 由于网格蛋白小泡一般直径在100~150 nm之间，故网格蛋白介导的细胞内吞途径是粒径在100~150 nm之间纳米粒子内吞的主要途径之一。 多数具有细胞膜表面蛋白靶向的基团修饰的纳米粒子(如靶向转铁蛋白)主要通过网格蛋白介导的细胞内吞途径，这是因为靶向基团与细胞膜蛋白结合后促进了网格蛋白和衔接蛋白的招募。 28 膜窖蛋白介导内吞 caveolin-dependent endocytosis 纳米粒与细胞膜表面粘附后在膜窖蛋白、鞘糖脂和胆固醇所形成的细胞膜特异性内陷结构——“脂筏”的作用下形成膜窖蛋白包被的小泡并被转运至细胞质内。 由于膜窖蛋白包被小泡直径一般在50~80 nm之间，故膜窖蛋白介导的细胞内吞途径一般是粒径较小的纳米粒的主要内吞形式。 膜窖蛋白介导的内吞所形成的内吞小泡不与溶酶体融合，从而可以降低溶酶体对于负载基因药物的破坏。 29 细胞内释放 基因药物/载体复合物的逃逸 基因药物/载体复合物的解体 ——基因药物的释放 30 环境响应型基因载体 pH响应 氧化还原响应 酶响应 光热响应 磁响应 超声响应 31 质子海绵效应 当溶酶体内物质不断消耗质子泵（V-ATPase）提供的质子导致溶酶体内的pH上升时，溶酶体能够大量捕获质子，质子泵持续开放，并引起氯离子和水分子内流，导致溶酶体渗透性肿胀，最后溶酶体破裂从而将内吞物释放到细胞质。 32 一些聚合物中仅含有少量的阳离子起到负载基因药物的作用，但其结构中含有具有酸环境响应的化学键，可以在内涵体酸环境下发生断裂，聚合物在内涵体中发生快速水解，从而使得内涵体内的摩尔浓度瞬间上升，产生较高的渗透压，进而使水分子不断从细胞质中渗透到内涵体中，并最终导致内涵体涨破。该过程被称为凝胶渗透压效应。 凝胶渗透压效应 33 氧化还原响应 二硫键（-S-S-），二硒键（-Se-Se-），响应细胞内谷胱甘肽 34 pH响应膜融合脂质体逃逸 35 光热响应 热响应、光-热转换、近红外光响应等 金纳米棒、量子点、近红外光敏剂、石墨烯等 光动力疗法：光敏剂吸收特定波长光线，在分子氧的参与下，产生单态氧和/或自由基，氧化破坏组织和细胞中的各种生物大分子，使异常增生活跃的细胞发生不可逆的损伤，最终使细胞死亡，达