微生物应用技术 第七章 微生物的遗传变异与育种 第七章 微生物的遗传变异与育种.ppt

（3）作为基因工程中的受体，至今用的最多的都是具有优越体制、培养容易和能高效表达供体性状的各种微生物细胞，尤其是E.coli、Bacillus subilis和Saccharomyces cerevisiae3种常见微生物； （4）作为基因工程的直接成果仅是一株带有新性状的“工程菌”或“工程细胞”，而要它们进一步发挥巨大的经济效益和社会效益，还必须通过微生物工程(或称发酵工程)才能实现；（5）尽管基因工程中的供体可以是其他任何生物对象，但是，微生物却是一种常用的独特的基因供体，而且整个微生物界将是一个最为富饶的供体基因库。 第一节 遗传变异的物质基础 第二节 基因突变与诱变育种 第三节 基因重组 第四节 基因工程 第五节 菌种的衰退、复壮与保藏 由表7-4可见，在所获得的融合子中，有的根本不产生谷氨酸，如F5、F38、F220等；有的虽积累谷氨酸，但其产酸率很低，如F12、F268、F300等；有的谷氨酸产率介于两亲株之间，如F70；有的谷氨酸产率较两亲株都高，如F263、F288等。因此，人为定向筛选融合子是整个原生质体融合育种的重要环节。 2.原生质体融合育种的应用 随着原生质体融合育种技术的发展，育种成果不断涌现。丁友日方等以球形芽孢杆菌TS-1和苏云金芽孢杆H4为亲株，在2～3mg/ml溶菌酶浓度下，42℃酶解45min，获得了原生质体。其原生质体形成率和再生率分别为91.02%、37.6%及93.3%、31.2%。然后将获得的原生质体以1∶1比例混合，加入40%的PEG于42℃保温5min。结果获得了既杀双翅目又杀鳞翅目幼虫的融合子。 第三节 菌种保藏 微生物受外界环境的影响会经常地发生小机率的变异，这种变异可能造成菌种生产性状的劣化或自身死亡。生产菌株的获得是一项艰苦的工作，要使菌种在生产中长期保持优良的生产性状就必须设法减少菌种的退化和死亡，即做好保藏工作。 一、菌种的退化及其防治1.菌种退化 生产菌株生产性状的劣化或遗传研究菌株遗传标记的丢失均称为菌种退化。菌种退化涉及微生物的形态和生理等多方面的变化。例如产生孢子能力的丧失，发酵液中产物组成改变，主产物减少和副产物增加等。菌种退化是指细胞群体的变化，而不是指单个细胞的变化。 2.菌种退化的原因 菌种退化的一个重要原因是基因突变。与控制生产性状有关的基因的负突变可造成生产性状的严重劣化。以工业生产核苷酸或氨基酸的营养缺陷型菌种为例，缺陷型基因发生回复突变可使产量性状下降很大。这种个别细胞的回复突变频率很低，但由于具有生长优势，在传代过程中在数量比例上上升很快，尽管此时就斜面菌种而言退化细胞还只是少数，但发酵过程中这少数菌的存在会使退化性状表现强烈，成为事实上的退化菌种。 3.菌种退化的防治（1）菌种选育方法---由于多核微生物诱变及单核微生物单链突变后均会发生分离回复，在选育菌种时应使用单核细胞，避免对多核细胞进行处理；采用较高剂量可使单链突变而使另一单链丧失作为模板的能力，减少分离回复。同时，在诱变处理后进行充分的后培养及分离纯化，以保证保藏菌种纯粹，不再发生分离回复。增加突变位点也能达到防止退化的效果。 （2）菌种保藏方式---保藏温度影响自发突变，且影响细胞活力。斜面保藏于4℃时，突变的可能性大，且斜面保藏一般每3个月到半年需传代1次，这对菌种不利。因此，作为生产菌株需同时采用斜面保藏和其它的保藏方式如冷冻干燥孢子、砂土管及液氮保存等，后几种方式可大大减少传代的次数。斜面保藏菌也应使每次传代的斜面足够生产上使用相当长时间，以减少传代次数。 （3）菌种培养条件---各种变异的生产菌株对培养条件的要求和敏感性不同。要满足变异菌株的生长要求，并控制培养条件防止菌种退化： ①给予营养缺陷型菌适当的营养必需成分可以降低回复突变频率； ②给予抗性菌以一定浓度的药物，可以使回复的敏感型菌株的生长受到抑制，而生产菌能正常生长； ③控制培养基中氮源或碳源的性质，使之有利于生产菌株而不利于退化菌株的生长，从而限制退化菌株的数量上升； ④改变培养pH、温度等条件防止退化。如栖土曲霉3.942培养中，使培养温度由28～30℃提高到30～34℃防止了产孢子能力的衰退。由于微生物生长可使培养基成分发生变化，积累有毒害性物质，因此生产中应避免使用陈旧的培养物作为种子。 （4）菌种管理措施---菌种管理不仅在于保藏、传代和使用，还涉及复壮、分离及纯化等工作。定期有针对性地进行分离纯化是极重要的。纯化可以用琼脂平板划线分离、稀释分离的方法，从单菌落性状中去除退化的菌落，保留原有典型形态的菌落。对于纯化所得单菌落还需作生产性状测试，以保证性能优良。 二、菌种的复壮1.纯种分离 通过纯种分离，可把退化