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流式细胞术的基本原理 流式细胞术（flow cytometer，FCM）： 利用流式细胞仪对处于快速直线流动状态中的单列细胞或生物颗粒进行逐个、多参数、快速的定性、定量分析或分选的技术。流式细胞仪：是集现代物理电子技术、激光技术、光电测量技术、计算机技术以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术于一体的先进科学技术设备流式细胞仪分为四部分：1）流动室与液流系统2）光源与光学系统3）信号收集、转换与分析系统4）细胞分选系统1）流动室与液流系统2）光源与光学系统激光（单色性、单向性）前向散射（FSC）侧向散射（SSC）激发波长发射波长3）信号收集、转换与分析系统激发波长经过滤光片分离不同波长的光信号分别到达不同的光电倍增管(PMT)，PMT将光信号转换成电信号，电信号输入到放大器放大。放大器分两类：线性放大和对数放大。细胞DNA含量、RNA含量、总蛋白质含量等的测量一般选用线性放大测量。 细胞膜表面抗原等的检测，由于表面抗原的分布有时要相差几十倍，甚至几万倍，故取对数放大。光谱重叠与荧光补偿实际中激发波长是正态或偏态曲线，荧光素之间的波谱常有重叠，故流式细胞仪加入了电子补偿系统，去除因光谱重叠而进入其他荧光探测器的荧光信号，即荧光补偿。流式细胞术的对照设置?阴性对照：调节荧光探测器合适的放大倍 数，将仪器归零，确定样本的基础荧光域值?阳性对照：检测抗体是否有问题或确定实验方法的稳定性、准确性?空白对照：不标记，自发荧光PS：补偿对照：多色分析样本时为荧光光谱 重叠进行的的补偿调节+488 nm laserFALS SensorFluorescence detector-Charged PlatesSingle cells sortedinto test tubes4）细胞分选系统根据某参数决定细胞液滴是否被分选，然后由充电电路对其充电，带电液滴通过静电场发生偏转而分离流式细胞术流程应用细胞膜：流动性、膜电位、膜通透性细胞内离子浓度：H+、Na+、K+和Ca2+细胞周期：全周期分析、S期分析、M期分析细胞表面蛋白质分析：免疫细胞分型、其他表面蛋白分析细胞功能：如凋亡、抗药性基因表达：内源及外源基因表达细胞分选细胞克隆Thank you！特点：单列细胞或生物颗粒逐个检测、高通量检测（每秒数万个）、多参数多色荧光分析、定性或定量分析细胞、细胞分选鞘液充满流动室，并将样本流环包，形成同轴流动，使得样品流在鞘流液约束下细胞成单行排列依次通过激光检测区（激光与细胞悬液的轴心正交），并且保证每个细胞通过激光照射区的时间相等，从而得到准确的细胞荧光信息。物理属性（细胞固有属性），其散射波长与激光波长相等前向散射：与细胞直径相关，细胞越大，FSC越大侧向散射（又称90°散射）：与细胞内颗粒结构的质量有关，细胞内颗粒结构越复杂、质量越大，SSC越大给细胞表面抗原相对应的抗体标上荧光染料，在激光的照射下发出不同波长的荧光，根据激发波长和荧光染料的不同，可激发出不同的波长荧光信号---化学属性（人为的属性）阴性对照：1.免疫球蛋白同型对照（反映待测标本对抗体非特异性结合的水平）2.封闭抗体对照（用抗体封闭以阻断待测标本对特异性荧光抗体的非特异性吸附作用，降低待测标本的基础荧光域值）3.阴性细胞对照（不表达抗原的细胞，确定抗体的特异性）4.正常血清或IgG对照（常用于间接免疫荧光的二抗，封闭二抗与样本的非特异性结合）荧光抗体的标记---样品、鞘液---激光---前向散射检测器、荧光检测器、充电信号---分选系统（充电、电场偏转）