基于山葡萄全转录组分析低温锻炼期差异基因及VvINVA基因的功能鉴定.pdfVIP

摘 要 在葡萄响应生物胁迫和非生物胁迫过程中已经有较广泛的研究关注mRNA ， 但在CircRNA、lncRNA、miRNA 中的研究中较少。我们在这项研究中，以抗寒 性较强的山葡萄（Vitis amurensis）为试材，通过北方自然低温生长锻炼为处理， 分别设定生长期（A，28±1 ℃）、抗寒初期（B，4±1 ℃）、抗寒中期（C ，0±1℃）、 抗寒后期（D，-5±1℃）和深休眠期（E，- 10±1℃）共5 个时期，并将这五个时 期两两差异对比细分为Ⅰ- Ⅹ这十个对比。通过RNA-seq、miRNA-seq 并分析得 到以下结果： 1. 本研究在 5 个不同低温锻炼期的山葡萄样品在 mRNA 、lncRNA 及 CircRNA 中获得了Clean Data 总共87.95Gb 。将得到的四种RNA 进行KEGG 和 GO 分析，确定了在Ⅰ- Ⅹ这十个对比中BP 、CC 、MF 中的具体变化。与抗寒有 关的显著通路之一，淀粉和蔗糖通路，通过对这一通路的差异基因表达分析，分 别使用venn 图和热图和通路图，最终得到它们在抗寒锻炼期的阶段特异性和参 与的基因表达。 2. 我们从全转录组数据中获得了与抗寒相关的差异表达的21 个基因所对应 的其被调控的21 个miRNA，大多为未知miRNA，已知miRNA 仅有 miR3624 - 5P，vvi-miR396b ，vvi-miR397a 。并以关键的21 个miRNA 为节点，它与CircRNA 、 lncRNA 和mRNA 的共表达分析表明共有1603 个mRNA，有191 个lncRNA 和 875 个CircRNA 被找出与miRNA 有调控联系。用 15 个差异基因进行荧光定量 验证，有 13 个基因在qRT-PCR 和与第二代测序中RNA-seq 中具有表达趋势的 一致性。 3. 对 VvINVA 基因进行了克隆，发现了基因总长为2465bp ，CDS 片段长度 为1614bp，等电点为5.17，分子量为60080.59D。VvINVA 整个多肽链表现为亲 水性, 不含有信号肽和转运肽；该蛋白主要为不规则卷曲和延伸链组成；亚细胞 定位预测发现其可能定位于液泡中。在烟草中过表达该基因后发现转基因株系的 蔗糖和果糖含量均随着环境温度的降低而升高；在转基因植物中，MDA 含量显 著低于对照；电导率随着温度的下降逐渐上升，野生型叶片细胞较转基因型伤害 I 严重。转基因植株叶片中SOD、POD、CAT 活性均显著高于野生型，4 ℃较8℃ 低，可能发生了细胞膜损伤，说明转基因植株具有一定的抗低温特性。 关键词：山葡萄，全转录组，低温锻炼期，荧光定量PCR，INVA II Summary In the process of grapes responding to biological stress and abiotic stress, there have been more extensive studies focusing on mRNA, whlie little research has been done on CircRNA, lncRNA and miRNA. In this study, Vitis amurensis, which is more resistant to cold, were used as the test material, and treated with natural low-temperature growth exercises in the north. We set the growth period (A, 28±1ºC) and the initial cold resistance (B, 4 ±1ºC), intermediate cold resistance