高效液相色谱法(HPLC)的概述.pdfVIP

此帖与GC版的对应，是为了让大家更好的学习和了解LC 主要内容包括： 1.高效液相色谱法 （HPLC）的概述 2. 高效液相色谱基础知识介绍 （1——13楼） 3. 高压液相色谱HPLC 发展概况、特点与分类 4. 液相色谱的适用性 5.应用 高效液相色谱法 （HPLC）的概述 以高压液体为流动相的液相色谱分析法称高效液相色谱法 （HPLC）。其基本方法是用高压 泵将具有一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂泵入装有填充剂的色谱柱，经进样阀注 入的样品被流动相带入色谱柱内进行分离后依次进入检测器，由记录仪、积分仪或数据处理 系统记录色信号或进行数据处理而得到分析结果。 由于高效液相色谱法具有分离效能高、选择性好、灵敏度高、分析速度快、适用范围广 （样品不需气化，只需制成溶液即可）、色谱柱可反复使用的特点，在 《中国药典》中有5 0种中成药的定量分析采用该法，已成为中药制剂含量测定最常用的分析方法。 高效液相色谱法按固定相不同可分为液-液色谱法和液-固色谱法；按色谱原理不同可分 为分配色谱法 （液-液色谱）和吸附色谱法 （液-固色谱）等。 目前，化学键合相色谱应用最为广泛，它是在液－液色谱法的基础上发展起来的。将固 定液的官能团键合在载体上，形成的固定相称为化学键合相，不易流失是其特点，一般认为 有分配与吸附两种功能，常以分配作用为主。C18 （ODS）为最常使用的化学键合相。 根据固定相与流动相极性的不同，液-液色谱法又可分为正相色谱法和反相色谱法，当 流动相的极性小于固定相的极性时称正相色谱法，主要用于极性物质的分离分析；当流动相 的极性大于固定相的极性时称反相色谱法，主要用于非极性物质或中等极性物质的分离分 析。 在中药制剂分析中，大多采用反相键合相色谱法。 系统组成： （一）高压输液系统 由贮液罐、脱气装置、高压输液泵、过滤器、梯度洗脱装置等组成。 1.贮液罐 由玻璃、不锈钢或氟塑料等耐腐蚀材料制成。贮液罐的放置位置要高于泵体，以保持输 液静压差，使用过程应密闭，以防止因蒸发引起流动相组成改变，还可防止气体进入。 2.流动相 流动相常用甲醇-水或乙腈－水为底剂的溶剂系统。 流动相在使用前必须脱气，否则很易在系统的低压部分逸出气泡，气泡的出现不仅影响柱分 离效率，还会影响检测器的灵敏度甚至不能正常工作。脱气的方法有加热回流法、抽真空脱 气法、超声脱气法和在线真空脱气法等。 3.高压输液泵 是高效液相色谱仪的关键部件之一，用以完成流动相的输送任务。对泵的要求是：耐腐 蚀、耐高压、无脉冲、输出流量范围宽、流速恒定，且泵体易于清洗和维修。高压输液泵可 分为恒压泵和恒流泵两类，常使用恒流泵 （其压力随系统阻力改变而流量不变）。 （二）进样系统 常用六通阀进样器进样，进样量由定量环确定。操作时先将进样器手柄置于采样位置（L OAD），此时进样口只与定量环接通，处于常压状态，用微量注射器 （体积应大于定量环 体积）注入样品溶液，样品停留在定量环中。然后转动手柄至进样位置 （INJECT），使定 量环接入输液管路，样品由高压流动相带入色谱柱中。 （三）色谱柱 由柱管和填充剂组成。柱管多用不锈钢制成。柱内填充剂有硅胶和化学键合固定相。在 化学键合固定相中有十八烷基硅烷键合硅胶 （又称ODS 柱或C18 柱）、辛烷基硅烷键合硅 胶 （C8 柱）、氨基或氰基键合硅胶等，在中药制剂的定量分析中，主要使用ODS 柱。由 于ODS 属于非极性固定相，在分离分析时一般使用极性流动相，所以属反相色谱法。常用 流动相有甲醇－水或乙腈－水等，洗脱时极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱。 （四）检测器 在高效液相色谱法中主要使用紫外检测器 （UVD），可分为固定波长、可变波长和二 极管阵列检测器三种类型，以可变波长紫外检测器应用最广泛。检测器由光源、流通池和记 录器组成，其工作原理是进入检测器的组分对特定波长的紫外光能产生选择性吸收，其吸收 度与浓度的关系符合光吸收定律。 高效液相色谱基础知识介绍 （1——13 楼） 一、基本概念和术语 1.色谱图和峰参数 ⊕色谱图 （chromatogram）--样品流经色谱柱和检测器，所得到的信号－时间曲线，又称 色谱流出曲线 （elution profile）. ⊕基线 （base line）--流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出一段时间的流出曲