使用微载体在生物反应器中制备Vero细胞狂犬病疫苗的试验(1)精品资料.pdf

使用微载体在生物反应器中制备 Vero 细胞狂犬病疫苗的试验 一、材料 1、 微载体 GE 公司 Cytodex 1 ，25g 2、 生物反应器 上海日泰公司 Cellipower 5L ，工作体积 3.5L 加微载体 25g （约7g/L ） 3、 细胞、毒种、培养液 二、操作过程 1、 微载体处理、反应罐准备 取微载体 25g 用 PBS溶液洗涤几次后室温下浸泡膨胀过夜。弃去上清液，将载体 转移到 2L 瓶内加入 PBS约 1L，灭菌后备用。 将微载体装到生物反应罐内， 换上新的 PBS溶液 4L，安装好生物反应罐灭菌 （126℃ *80min ）。 2、 生物反应器校正、调试 反应罐灭菌前调试生物反应器， 确保能正常运行， 各参数正常。 用 pH 为 7.0/10.0 的标准缓冲液校正 pH 电极 2 次。灭菌后，温度 37℃校正 DO电极。 3、 预培养 DO 电极校正完后，关闭进气，停止搅拌，过 15 分钟待载体沉降后排空上清液， 加入 199 培养液 3 L 浸泡处理载体，浸泡 3 小时后同样关闭进气停止搅拌 15 分钟后排 空上清液，加入 7.5%新生牛血清培养液 3L ，设置温度 37℃、 pH7.2、DO 50、搅拌转 速 60RPM，预培养过夜，留意反应器运行是否正常，各参数是否稳定能调控。 4 、 接种细胞 接种细胞当天先排空反应罐内预培养的 7.5%新生牛血清培养液，重新加入 7.5% 新生牛血清培养液 3L ，设置温度 37℃、pH7.2 、DO50、搅拌转速 60RPM。待温度稳定 在 37℃后取样校正 pH值，然后准备接种细胞。 关闭温度、 pH 、DO 控制，关闭进气，搅拌转速设为 30RPM ，将适量细胞悬液缓 9 5 缓加入反应罐内，接种细胞总数为 1.8*10 个（密度约5*10 个/ml ），温度慢慢调回 37℃， 接种细胞后 2 小时开始进气，开启 pH 、DO 控制，设置温度 37℃、 pH7.2、DO50、搅 拌转速 30RPM。搅拌转速在接种细胞 4 小时后设为 40RPM、5 小时后设为 50RPM、6 小 时后设为 60RPM，开始进入细胞培养阶段。 批号定为 5、 细胞培养 设置温度 37℃、pH7.2 、DO50、搅拌转速 60RPM并维持稳定，进行细胞培养。每 天取样一次（ 2 管）检测葡萄糖含量、进行显微镜观察。适当调整灌注量，维持葡萄 糖含量大于 1g/L 。 6、 接种病毒 细胞培养 4 天已长满，进行病毒接种。关闭进气，停止搅拌，过 10 分钟待载体 沉降后排空上清液， 加入 1%新生牛血清培养液 3L ，10 分钟后排空上清液， 再加入 1% 新生牛血清培养液 3L ，设置温度 35℃、pH7.4 、DO50、搅拌转速 50RPM，待各参数稳 定后取样校正 pH值。关闭温度、 pH 、DO 控制，关闭进气，搅拌转速设为 30RPM， 然后将 50ml 毒种接种入反应罐内。 温度慢慢调回 35℃，接种病毒后 30 分钟开始进气， 开启 pH 、DO 控制，设置温度 35℃、 pH7.4、DO50、搅拌转速 30RPM。搅拌转速在接 种病毒 3 小时后设为 40RPM、5 小时后设为 50RPM。接种病毒 6 小时后开始灌注 1%新 生牛血清培养液 7L/ 天。开灌注前取样。 7、 洗换 接毒第二天先取样，再洗换 5 次，每次加入 1