(完整版)提取细胞RNA的步骤.docx

提取细胞 RNA 的步骤： 六孔板每孔细胞中加入 1ml Trizol ，冰上放置 5min ，枪头吹打。 将各孔裂解液吸到 1.5 ml EP 管中，加入氯仿 0.2ml/ 管，用力振摇 15s。15－ 30℃下孵育 2-3min ， 离心（ 4℃， 12， 000g ， 15min ）。 离心后液体分为三层（上层－无色水样层为RNA ，中层白色为 DNA 和底层红色为蛋白质）， 小心吸取上层无色液体移入一新的 EP 管中。 4) 加入等体积异丙醇， 0.4－ 0.5ml ，混匀， 15-30℃下孵育 10－ 30min ，离心（ 4℃， 12 ，000g ， 10min ）。其中如果加入等体积异丙醇后，置于试管架上用 PE 手套密封后，放于 4℃冰箱中，沉 淀 30min 效果更好。 5) 去上清，沉淀加入 75％乙醇 1ml ，漩涡振荡 30s，离心（ 4℃， 7， 500g， 5min ）。 6) 小心去上清， 管内沉淀在超净台中鼓风静置干燥 3-5min 。最好是用枪头吸取上清， 尽量除去。 加入 20ul DEPC 水溶解，分装 5ul/ 管， -70 ℃冰箱保存。 8) 细胞总  RNA  的鉴定：  0.9-1.2 ％琼脂糖电泳鉴定细胞总  RNA ，观察出现条带及各条带亮度。 紫外分光光度计测定：  分别测定细胞总  RNA  在  260nm  和 280nm  处的光密度值  (OD), 并计算  RNA 的含量和纯度。 1、实验目的 提取人体细胞的总 RNA 和 mRNA 。 2、本实验所需试剂 1）、 CNE-2 细胞及培养细胞的一系列条件， 2）、 PBS 缓冲液， TRIZOL 试剂， 3）、 DEPC 处理过的水、大、中、小 Tip 及 1.5 ml EP 管 , 4）、新的氯仿、异丙醇和乙醇， 5）、 mRNA 分离试剂盒： Oligotex mRNA Mini Kit,Cat.no.:70022, QIAGEN 。 6）、新配的电泳缓冲液，专跑 RNA 的琼脂糖（ Agarose）。 3、实验流程 3.1 细胞总 RNA 的提取 1）、 6 孔板细胞（ CNE-2 ）汇合度为 90-100% 时，取出无菌室，去其上清，用 PBS 洗两次 后，每孔加 TRIZOL 试剂（ Gibco 公司） 1 ml ，摇匀，无菌罩内消化 3-5 分钟（观察：液体 变粘稠，细胞脱壁）。 2）、将各孔内消化好的细胞裂解液吸到一 DEPC 处理过的 1.5 ml EP 管中，加新开的氯仿 0.2 ml ，轻摇  15 秒。 3）、室温静置 2-3 分钟后， 12000 rpm，15 min ，4℃，离心。 然后取上清无色水相 （约 到 EP 管（ DEPC 处理过），加 0.5 ml 新开的异丙醇，室温下静置 10 分钟。  0.6 ml ） 4）、 12000 rpm ，10  分钟，  4℃，离心。观察总  RNA  在管底的白色沉淀，弃去上清（小心 别丢了沉淀），  75%乙醇  1.0 ml  洗涤（用  DEPC  水新配制）后，  7500 rpm ，5 min ，4℃离心。 5）、去上清， 点离， 用小 Tip 吸干液体。 气干沉淀 5-10 分钟， DEPC 处理水 20-30 ul 加入，中枪打匀， 55-60 ℃水浴 10 分钟溶解总 RNA ，测 OD 值。 6）、电泳。 3.2 从总 RNA 中分离 mRNA （ Oligotex mRNA Mini Kit,Cat.no.:70022, QIAGEN ） 1）、取上述提取的总 RNA 若干（少于 0.25 mg ）到一个新的无 RNase 的 EP 管中，用无 RNase 的水定容到 250 ul 。 2）、加入 Buffer OBB 250 ul, Oligotex Suspension 15 ul 。用 Tip 打匀或用手弹匀。 3）、 70℃水浴， 3 分钟（裂解 RNA 的二级结构）。 4）、 20-30 ℃条件下，静置 10 分钟（让 Oligotex 与 mRNA 结合）。 5）、高速离心 2 分钟，小心吸走上清（该上清要保留），留下约 50 ul 的上清在原管里。 6）、用 Buffer OW2 400 ul 重悬含 Oligotex/mRNA 复合物的沉淀， 然后将这些加到套有 1.5 ml EP 管的 SPIN 柱子上，高速离心 1 分钟。 7）、将 SPIN 柱子移到一个新的 EP 管上，加 Buffer OW2 400 ul 到柱子，高速离心 1 分钟， 丢掉滤过液。 8）、将 SPIN