（优质医学）重组质粒构建.ppt

6.双酶切： 根据重组的需要，有时需要用双酶切（单酶切：由于只有一种酶切，载体片段很容易相互粘连，形成空载体），这样重组效果会更好。 双酶切时要先分析两种酶且的条件，根据两种酶切的缓冲液要求，有三种情况 兼 容 性 处 理 完全兼容 同时加2种酶进行酶切 完全不兼容 先用一种酶切，沉淀洗盐，再用另一种酶切 相对兼容（其中一种酶活性相对较低） 同时加2种酶进行酶切 只是盐离子浓度不同 先用低离子要求的酶切，再补加酶和盐。 * 7.载体的酶切： 酶切条件与外源DNA没有区别。载体多位环状DNA,如果只有一个酶切位点，用单酶切。目前商业化载体均有多克隆位点，含有多个酶切位点，可以进行多种选择和取舍。 * 酶切产物回收 离心柱回收纯化酶切产物DNA片段 纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。 * 数据库 限制性内切酶的数据库/rebase 其中含有已知的所有限制性内切酶的完整表，包括识别的序列，甲基化的敏感性，商业信息和参考文献。 Company: TAKARA Fermentas * 连接酶（ligase) 主要有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。催化相邻DNA链的5’-P和3’-OH末端以磷酸二酯键结合。E. coli DNA 连接酶催化DNA分子连接的机理与T4噬菌体DNA连接酶基本相同，只是辅助因子不是ATP而是NAD+。 * * T4噬菌体DNA连接酶还有一种E. coli DNA连接酶没有的特性即将两个平末端的双链DNA分子连接起来的功能。对于这种连接反应的机理目前还不清楚，总的来说这种连接的效率比粘性末端的连接效率要低得多，可能是因为平末端DNA分子无法形成类似粘性末端分子那样的相对稳定的结构。 * Weiss单位（Weiss等,1968），是指在37oC下20分钟内催化1nM 32P从焦磷酸根置换到[?,?-32P] ATP所需酶量； （NEB公司，粘性末端）将1?g由HindIII酶解的?DNA的12碱基对粘性末端在160C条件下、30分钟、20?l反应体系中连接50?时所需酶量。 (Takara公司)在20?l的反应体系中，6?g的?DNA-HindIII的分解物在160C反应30分钟时，有90?以上的DNA片段进行连接的酶的活性为1U。 相当于 ATP-Ppi交换反应中0.008 Weiss U。 对于T4-噬菌体DNA连接酶的活性测定至少有三种以上的方法： * DNA重组——连接 DNA的连接主要有粘性末端和平端连接法，这些主要根据外源片段的末端性质、质粒性质以及两者的酶切位点来确定。 相同末端：直接将外源DNA和载体片段加在一起，进行连接； 不同末端：需要将外源DNA和载体DNA的末端调整成一致。多数情况是变成平末端，这可通过DNA酶降解，或DNA聚合酶不平的方式解决。 单酶切：由于只有一种酶切，载体片段很容易相互粘连，形成空载体，通常用去磷酸化的方法以避免。对于表达载体构建时，还需识别其方向。 双酶切：直接连接，并且方向是确定的，所以选择这一方案时，要考虑其方向性。 * 连接反应的一项重要参数是温度。理论上讲连接反应的最佳温度是37℃，此时连接酶的活性最高。但37℃时粘性末端分子形成的配对结构极不稳定，因此人们找到了一个既可最大限度地发挥连接酶的活性，又有助于短暂配对结构稳定的最适温度即12~16℃。 DNA的连接主要有粘性末端和平端连接法，这些主要根据外源片段的末端性质、质粒性质以及两者的酶切位点来确定。 * 一般外源片段较载体摩尔浓度高 ，5：1。有的加入聚乙二醇。可使反应速度加快。 连接反应： H2O 补充使总体10ul ATP（含在buffer 中） 10XBuffer