动物微生物与免疫技术 动物微生物与免疫技术、任务六 猪相关传染病的抗体的测定 技能点11ELISA.ppt

技能点11 ELISA 技能点11 ELISA 主要内容 一、目的要求 二、仪器及材料 三、方法与步骤 一、目的要求 掌握ELISA的基本操作步骤，了解猪群猪瘟抗体监测的意义。 二、仪器材料 酶联检测仪、酶标板、微量加样器(配带滴头)、猪瘟病毒、酶标SPA、猪瘟阳性血清、猪瘟阴性血清、待检血清、pH9.6碳酸盐缓冲液、洗涤液（PBS-T）、BSA(牛血清白蛋白)、封闭液、稀释液、底物溶液、30%H2O2、2mol/L H2SO4溶液、邻苯二胺（OPD）。 二、仪器材料 三、方法与步骤 PPA-ELISA检测猪瘟抗体效价 1．包被 用pH9.6碳酸盐缓冲液稀释猪瘟病毒抗原至1μg/ml，以微量加样器每孔加样100μl，置湿盒内37℃包被2～3h。 2．洗涤 用洗涤液（PBS-T）将反应板洗涤三次，每次5min，甩干。 三、方法与步骤 3．封闭 以微量加样器在每孔内加封闭液200μl，置湿盒内37℃封闭3h。 4．洗涤 重复第2步。 5．加待检血清 以微量加样器在每孔内加100μl稀释液，然后在酶标板的第1孔加100μl待检血清，以微量加样器反复吹吸几次混匀后，吸100μl加至第2孔，依次倍比稀释至第12孔，剩余的100μl弃去，置湿盒内37℃作用2h。 三、方法与步骤 6．洗涤 重复第2步 7．加酶标SPA 以稀释液将酶标SPA稀释至工作浓度，以微量加样器每孔加100μl，置湿盒内37℃作用2h。 8．洗涤 重复第2步。 9．加底物溶液显色 每孔加入新配制的底物溶液100μl，37℃避光显色10min。 三、方法与步骤 10．终止反应 加2mol/LH2SO4溶液终止反应，每孔50μl。 11．结果判定 以酶标仪检测样品的A490，检测之前，先以空白孔调零，当P/N≥2.1即判为阳性。 注意：每块ELISA板均需在最后一排的后3孔设立阳性对照、阴性对照和空白对照。 结果判定： 定性检测 结果判定： 定量检测 附：常用试剂的配制 1.包被液(0.05molpH9.6碳酸盐缓冲液)：Na2CO3 1.59g NaHCO3 2.93g 蒸馏水 1000ml。 2.缓冲液（0.01molpH7.4 PBS）：NaCl 8.0g；KH2PO4 0.2g；Na2HPO4 2.9g；KCl 0.2g；蒸馏水 1000ml。 3.洗涤液（0.01molpH7.4PBS-吐温20）：Tween-20 0.5ml；0.01M pH7.4 PBS；1000ml。 4.封闭液（1%BSA-PBS-T）：BSA 1.0g；PBS-T 100ml。 5.底物缓冲液（pH5.0磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液）：柠檬酸 4.6656g；Na2HPO4 7.2988g；蒸馏水 1000ml。 6.底物溶液（临用前新鲜配制，配后立即使用）：邻苯二胺(OPD) 40mg；30%H2O2 0.15ml；底物缓冲液 100ml。 7.终止剂（2mol/LH2SO4）：H2 SO4 22.2ml；蒸馏水 177.8ml。 ? 技能点11 ELISA