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实验十一 细菌质粒 DNA 的提取和纯化 一、实验目的： 通过细菌质粒 DNA的提取，掌握共价闭合环状 DNA的提取方法。 二、实验原理： 1、细菌中有两种 DNA，即染色体 DNA和质粒 DNA。 2、质粒 DNA 的提取方法有三种：碱裂解法、煮沸法和去污剂（如 Triton 和 SDS）裂解法。 3、碱裂解法比较剧烈，可破坏碱基配对，使宿主细胞 DNA变性，共价闭合 环状 DNA由于空间缠绕， 两条链不会彻底分开。 当外界条件到达复性条件时， 质 粒 DNA的双链又迅速恢复原状，而较大的线性染色体 DNA难以复性。 当菌体在 NaOH和 SDS 溶液中裂解时，蛋白质与 DNA发生变性，当加入中和 液后，质粒 DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与 染色体 DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。 纯化质粒 DNA的方法通常是利用了质粒 DNA相对较小及共价闭环两个性质。 例如，氯化铯 - 溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二 醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。对于小量制备的质粒 DNA，经 过苯酚、氯仿抽提， RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和 RNA， 所得纯化的质粒 DNA已可满足细菌转化、 DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及 探针标记等要求，故在实验室中常用。 三、 实验材料： 含有 PMD19质粒的大肠杆菌（ E. coli. ）菌液 四、实验用具和药品： 实验用具：摇床、离心机、移液器及枪头、玻璃试管（ 15mL）及塞子、离心 管（ 1.5mL）。 实验药品： 溶液Ⅰ（高压灭菌） ： 50 mmol/L 葡萄糖 25 mmol/L Tris.Cl （pH8.0 ） 10 mmol/L EDTA （pH8.0） 溶液Ⅱ（现用现配） ： 2 mol/L NaOH 10% SDS （十二烷基硫酸钠） 2 NaOH ： SDS：ddHO=1:1:8 溶液Ⅲ： 5 mol/L 乙酸钾 60mL 冰乙酸 11.5mL 水 28.5mL 五、实验步骤： （一）细菌繁殖 第 1 天晚上： 吸取含质粒的菌液 2 μL，转移入 2mLLB （加入相应抗生素）， 37℃，过夜振荡（ 200r/min ）培养。 （二）菌体收集 第 2 天早晨 ( 时间 : 约 2-3h 左右 ) ： 1 、将过夜培养的菌体转入 1.5mL 离心管， 5000r/min 离心 30sec；2、弃上清 （三） 碱裂解法提取质粒 DNA 1、将上述沉淀重悬于 100 μL 冰预冷的溶液Ⅰ中， 剧烈震荡 （须使沉淀完全 分散） ( 葡萄糖：悬浮细胞； EDTA；抑制 DNAase) 2、加入 200 μL 溶液Ⅱ，盖紧管口，轻柔颠倒离心管 5~ 10 次，该过程应小 于 5min；（NaOH：溶解细胞膜，释放