教学服务模块 教学课件、课件 重组DNA技术.pptxVIP

生物化学重庆医药高等专科学校 张静文重组DNA技术DNA Recombination Technique 重组DNA技术的发展史年 G.J.Mendel的豌豆杂交试验1944年 O.T.Avery的肺炎球菌转化实验1973年 美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组DNA分子1977年 美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的药物。1980年 开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂1997年 英国罗林研究所成功的克隆了多莉本节主要内容一、相关概念DNA克隆工具酶目的基因基因载体二、基本原理及操作步骤一、重组DNA技术相关概念（一） DNA克隆克隆(clone)来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)，即无性繁殖。DNA克隆应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子——复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或重组DNA (recombinant DNA) 。生物技术工程: 基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等。基因工程(genetic engineering) —— 实现基因克隆所用的方法及相关的工作，又称重组DNA技术。目的① 分离获得某一目的基因或DNA② 获得目的基因的表达产物（蛋白质）（二）工具酶 限制性核酸内切酶 DNA聚合酶Ⅰ 逆转录酶 T4DNA连接酶 碱性磷酸酶 末端转移酶 Taq DNA聚合酶重组DNA技术中常用的工具酶工 具 酶功 能限制性核酸内切酶识别特异序列，切割DNADNA连接酶催化DNA中相邻的5′磷酸基和3′羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接DNA聚合酶Ⅰ合成双链cDNA分子或片段连接缺口平移制作高比活探针DNA序列分析填补3′末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的5??3?聚合、3??5?外切活性，而无5??3?外切活性。常用于cDNA第二链合成，双链DNA 3?末端标记等反转录酶合成cDNA替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5′羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶在3′羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶切除末端磷酸基GCCTAGGGATCCCCTAGGGATCC G限制性核酸内切酶　(restriction endonuclease)识别DNA的特异序列, 并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类核酸内切酶。Bam HⅠ+分类：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类（基因工程技术中常用的是Ⅱ类）作用：与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA， 保护自身DNA。命名：Hin dⅢHaemophilus influenzae d株流感嗜血杆菌d株的第三种酶 属 系 株 序第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。GGATCCCCTAGGⅡ类酶识别序列特点： —— 回文结构(palindrome)切口：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGGGTCGACCAGCTGGCCTAGGATCC GGTCCAGGACCTGHindⅡBam HⅠ++平端切口粘端切口 AGATCT TCTAGA GGATCC CCTAGG GATCC GATCTAG GATCT AGCCTAG有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端(compatible end)。Bg lⅡBam HⅠ++（三）目的基因 cDNA (complementary DNA)基因组DNA (genomic DNA)（四）基因载体定义为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。常用载体质粒DNA噬菌体DNA病毒DNA克隆载体(cloning vector)为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。表达载体(expression vector) 为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。载体的选择标准能自主复制；具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；分子量小，以容纳较大的外源DNA。1. 质粒 (plasmid)　细菌染色体外的小型环状双链DNA分子。特点: 　能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息, 会赋予宿主细胞一些遗传性