wb实验步骤详细总结.pdfVIP

蛋白提取 （所有操作在冰上进行） 1. 裂解 1) 配裂解液： PMSF=100 ： 1，（裂解液和 PMSF 在 -20 ℃保存，提前一天 4 ℃解冻） 取 2ml 裂解液，加 20 μl PMSF 混匀 2) 称取 30mg 组织，切碎放入标记好的 AP 管中，加入 600 μl 上述 1 中液体（加入液 体与组织比例为 20 ：1），冰上静置 10min 2. 匀浆 先用超纯水润洗一下匀浆机的钢头，（同时进行几组匀浆时，组间也要润洗钢头） 在匀浆机（在生化室）上每次匀浆 10s，两次（间隔 5s），冰上静置 30min 3. 离心 （在基础 4 楼 416 室） 1) 自带 1ml 枪以及蓝枪头和黄枪头，三个 1.5 的离心管（①，②两个标记，③加少量 超纯水，③号是为了离心平衡，对称放置） 2) 将离心机预冷至 4 ℃为止，以 1200×10r/min 离心 15min 3) 用移液枪将上层清液取出放入①②号管中 4. 变性 （上样缓冲液：样品 =4 ： 1） 将样品转移至 2~3 个 0.5mlAP 管中 加上样缓冲液， 100℃变性 10min 仪器屏幕： S5 00 ： 10 S5 100 ．0 00 ： 10 温度（℃） 时间（时：分钟） 5. 保存 变性结束后，打开 AP 管盖放一下气，然后 4 ℃保存，点样是取出即可用 WB 实验步骤 1. 清洗玻璃板： 清洗玻璃板后风干， 将玻璃板对齐后放入夹中卡紧， 操作时要使两玻璃对 齐，以免漏胶。 2. 配制分离胶 1) 准备： 1ml 枪（蓝色枪头）， 200 μl 枪（黄色枪头） 10 μl （白色枪头） 2) 10% 分离胶的配置：（用 50ml 烧杯。 1.0mm 板配 1.5 块胶， 1.5mm 板配 2 块板） 5.91ml 超纯水 4.95ml 丙烯酰胺（ 30% ）避光保存极易失效 3.75ml Ph8.8Tris ?HCL 10%SDS 150 μl 150 μl AP （催化剂促凝作用） TEMED 9 μl 混合摇匀（用移液枪抽吸混匀液体，不要将液体完全打出防止气泡） 3. 灌胶 沿玻璃板右上角缓慢匀速加入分离胶（用 1ml 移液枪，不要将移液管内液体完全打出 防止气泡）保持液面平稳上升至上方绿色线为止 4. 水封 立即用 1ml 超纯水进行水封（利用重力把胶压平），如有气泡则用针头吸出防止影响 电泳效果，等待 20-30min 5. 浓缩胶的配制（ 5% ） 4.13ml 超纯水 1ml